S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Introductie
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - de veroorzaker van Phytophthora, de economisch meest belangrijke ziekte van aardappelen en tomaten - trekt al meer dan anderhalve eeuw de aandacht van onderzoekers uit verschillende landen. Het verscheen plotseling in Europa in het midden van de XNUMXe eeuw en veroorzaakte een aardappelepidemie die in de herinnering is gebleven van vele generaties.
Tot nu toe wordt het vaak de "paddenstoel van de Ierse honger" genoemd. Bijna honderd jaar na de eerste epidemieën werden wilde Mexicaanse aardappelsoorten ontdekt die resistent zijn tegen Phytophthora, werden methoden ontwikkeld om ze te kruisen met gecultiveerde aardappelen (Muller, 1935) en werden de eerste Phytophthora-resistente rassen verkregen (Pushkarev, 1937). Kort na de start van hun commerciële teelt stapelden zich echter rassen van de Phytophthora-ziekteverwekker op die virulent waren voor resistente rassen. en de introductie van nieuwe resistentiegenen van wilde Mexicaanse aardappelen in rassen begon snel aan effectiviteit in te boeten.
Mislukkingen met het gebruik van monogene (verticale) resistentie dwongen fokkers om op zoek te gaan naar meer complexe manieren om niet-specifieke polygene (horizontale) resistentie te exploiteren. In de afgelopen jaren zijn zeer agressieve rassen begonnen zich op te hopen in individuele populaties van de parasiet, waardoor erosie van zelfs niet-specifieke weerstand ontstaat. De komst van fungicidenresistente stammen heeft problemen veroorzaakt bij het gebruik van aardappelbeschermingschemicaliën.
Vanwege de significante verschillen tussen oömyceten en schimmels in chemische samenstelling, ultrastructuur en metabolisme, zijn fungiciden, vooral systemische die worden gebruikt om planten tegen veel schimmelziekten te beschermen, niet effectief tegen oömyceten.
Daarom werd bij de chemische bescherming tegen Phytophthora meervoudig (tot 12 keer per seizoen of meer) sproeien met contactpreparaten met een breed werkingsspectrum gebruikt. Een revolutionaire stap was het gebruik van fenylamiden, die giftig zijn voor oömyceten en systemisch in planten worden verspreid. Hun wijdverbreide gebruik leidde echter al snel tot de accumulatie van resistente stammen in schimmelpopulaties (Davidse et al., 1981), wat de bescherming van planten aanzienlijk bemoeilijkte. P. infestans is praktisch de enige parasiet van de gematigde zone, waarvan de schade in de biologische landbouw niet kan worden geneutraliseerd zonder het gebruik van chemische beschermingsmiddelen (Van Bruggen, 1995).
Het bovenstaande verklaart de grote aandacht die onderzoekers uit verschillende landen besteden aan de studie van P. infestans-populaties, de dynamiek van hun overvloed en genetische samenstelling, evenals de genetische mechanismen van variabiliteit.
Levenscyclus van R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans ontwikkelt een intercellulair mycelium met haustorie in aardappelbladeren. Het voedt zich met de weefsels van het blad en veroorzaakt de vorming van donkere vlekken, die bij nat weer zwart worden en rotten. Bij een sterke nederlaag sterft het hele blad. Na een periode van voeden worden uitgroeisels gevormd op het mycelium - sporangioforen - die door de huidmondjes naar buiten groeien. Bij nat weer vormen ze een witte bloei rond de vlekken aan de onderkant van de bladeren. Aan de uiteinden van de sporangioforen worden citroenvormige zoösporangia gevormd, die afbreken en worden meegevoerd door opspattend regenwater (figuur 1). Door in druppels water op het oppervlak van een aardappelblad te komen, ontkiemen sporangia met 6-8 zoösporen, die na een periode van beweging zijn afgerond, bedekt met een schaal en ontkiemen met een spruitbuis. De spruit dringt door de huidmondjes in het bladweefsel. Onder bepaalde omstandigheden kunnen sporangia in een kweekbuis direct uitgroeien tot bladweefsel. Onder gunstige omstandigheden is de tijd van infectie tot de vorming van nieuwe sporulatie slechts 3-4 dagen.
Eenmaal op de grond en gefilterd door de grond, kunnen sporangia knollen infecteren. Ernstig aangetaste knollen rotten tijdens opslag; bij de zwak getroffen personen kan de infectie aanhouden tot het volgende seizoen. Bovendien kan de veroorzaker van Phytophthora in de winter aanhouden in de vorm van oösporen (dikwandige rustende seksuele sporen) in de bodem op plantenresten en op tomatenzaden. Oösporen worden gevormd op levende plantorganen wanneer stammen van verschillende paringstypen te veel vocht bevatten. In het voorjaar wordt aseksuele sporulatie gevormd op geplante geïnfecteerde knollen en op plantenresten met oösporen; zoösporen komen in de bodem en veroorzaken infectie van de onderste bladeren van planten. In sommige gevallen kan mycelium uit de geïnfecteerde knol langs het groene deel van de plant groeien en meestal in het bovenste deel van de stengel verschijnen.
Een significant verschil tussen oömyceten en de meeste schimmels ligt in het overwicht van diplofase in hun levenscyclus met gametische meiose en kieming van zygoten (oösporen) zonder reductieve kernsplijting. Dit kenmerk, plus dipolair heterotallisme, dat biseksualiteit vervangt, lijkt het mogelijk te maken om op oomyceten de benaderingen toe te passen die zijn ontwikkeld voor het bestuderen van populaties van hogere eukaryoten (analyse van panmixie en onderverdeling van populaties, intra- en interpopulatiegenstromen, enz.). Drie factoren laten echter niet toe deze benaderingen volledig over te dragen in de studie van P. infestans-populaties.
1. Samen met hybride oösporen worden zelfvruchtbare en parthenogenetische oösporen gevormd in populaties (Fife en Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), en de frequentie van hun vorming kan voldoende zijn om te beïnvloeden op de testresultaten.
2. Het seksuele proces bij P. infestans levert een onbeduidende bijdrage aan de dynamiek van de populatiegrootte, omdat de schimmel zich voornamelijk voortplant door vegetatieve sporen en meer dan 90% van de resultaten vormt van de analyse van het paringstype volgens de traditionele methode op een voedingsbodem. ... het groeiseizoen verschillende generaties van aseksuele sporulatie (ontwikkeling van polycyclische ziekten). Oösporen spelen een belangrijke rol bij het behoud van het organisme in de periode dat er geen groene planten zijn (in de winter) en bij de primaire infectie van zaailingen. Dan treedt tijdens de zomer klonale voortplanting op en een toename of juist een afname van het aantal individuele klonen dat is ontstaan als gevolg van seksuele recombinatie, wat voornamelijk wordt bepaald door de selectie van de meer aangepaste. Daarom kan de verhouding van individuele klonen in een populatie aan het begin en einde van epifytotica totaal verschillend zijn.
3. De beschreven cyclus is kenmerkend voor de inheemse populaties van P. infestans in hun thuisland, Midden-Amerika. In andere delen van de wereld was het seksuele proces al meer dan 100 jaar niet bekend; het vegetatieve mycelium in geïnfecteerde aardappelknollen was de overwinteringsfase. De levenscyclus was volledig agamisch en de verspreiding was centraal van aard: de infectie van enkele geïnfecteerde geplante knollen ging over naar de bladeren en vormde primaire brandpunten van de ziekte, die konden samensmelten tijdens de massale ontwikkeling van de ziekte.
In sommige regio's kan er dus een afwisseling zijn van seksuele en aseksuele cycli, terwijl in andere alleen aseksuele cycli zijn.
Herkomst van P. INFESTANS
P. infestans verscheen aan het einde van de eerste helft van de 1991e eeuw in Europa. Omdat de aardappel inheems is in het noordoosten van Zuid-Amerika, werd aangenomen dat de parasiet van daar naar Europa werd gebracht tijdens de hausse van de Chileense salpeter. Echter, studies uitgevoerd op het Rockefeller Center aardappelstation in de Toluca-vallei, Mexico, dwongen dit standpunt te herzien (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. In de Toluca-vallei hebben lokale knolachtige aardappelsoorten (Solanum demissum, S. bulbocastanum, enz.) Verschillende sets genen voor verticale resistentie gecombineerd met een hoog niveau van niet-specifieke resistentie, wat duidt op een lange co-evolutie met de parasiet. Zuid-Amerikaanse soorten, waaronder aardappels, missen resistentiegenen.
2. In de Toluca-vallei worden isolaten met paringstypes A1 en A2 gevonden, waardoor de populatie van P. infestans met verschillende rassen wijdverspreid is; terwijl in het geboorteland van de aardappelteelt, Zuid-Amerika, de parasiet zich klonaal verspreidt.
3. In de Toluca-vallei zijn er jaarlijks ernstige epidemieën van Phytophthora. Daarom wordt onder Noord-Amerikaanse onderzoekers (Cornell University) de mening over Meso-Amerika (Midden-Amerika) als geboorteplaats van aardappel-phytophthora gevestigd (Goodwin et al., 1994).
Zuid-Amerikaanse onderzoekers delen deze mening niet. Ze geloven dat de gekweekte aardappel en zijn parasiet P. infestans een gemeenschappelijk thuisland hebben - de Zuid-Amerikaanse Andes. Ze ondersteunden hun standpunt met moleculaire studies over de analyse van DNA-polymorfismen van het mitochondriale genoom (mtDNA) en nucleaire genen RAS en β-tubuline (Gomez-Alpizar et al., 2007). Ze toonden aan dat de stammen die uit verschillende delen van de wereld zijn verzameld, afstammen van drie divergerende voorouderlijke lijnen, die (alle drie) worden aangetroffen in de Zuid-Amerikaanse Andes. Andes-haplotypes zijn afstammelingen van twee lijnen: isolaten van de oudste mtDNA-lijn worden gevonden op wilde Solanaceae uit de sectie Anarrhicomenum in Ecuador, terwijl isolaten van de tweede lijn veel voorkomen bij aardappelen, tomaten en wilde nachtschade. In Toluca stammen zelfs zeldzame haplotypes af van slechts één afstamming, waarbij de genetische variabiliteit van de Toluca-stammen (lage allelfrequentie van sommige variabele plaatsen) een sterk grondleggereffect suggereert als gevolg van recente drift.
Bovendien werd in de Andes een nieuwe soort P. andina gevonden, morfologisch en genetisch vergelijkbaar met P. infestans, die volgens de auteurs verwijst naar de Andes als een hotspot van soortvorming in het geslacht Phytophthora. Ten slotte, in Europa en de Verenigde Staten, omvatten P. Infestans-populaties beide Andes-geslachten, terwijl in Toluca er maar één is.
Deze publicatie lokte een reactie uit van een groep onderzoekers uit verschillende landen, die veel experimenteel werk verrichtten om het eerder uitgevoerde onderzoek te herzien (Goss et al., 2014). In dit werk werden ten eerste meer informatieve microsatelliet-DNA-sequenties gebruikt om DNA-polymorfismen te bestuderen; ten tweede voor de analyse van clustering, migratiepaden, tijdsverschillen van populaties, enz. er werden meer geavanceerde modellen gebruikt (F-statistieken, Bayesiaanse benaderingen, enz.) en ten derde werd niet alleen een vergelijking gebruikt met de Andes-soort P. andina, waarin een hybride karakter werd vastgesteld (P. infestans x Phytophthora sp.) maar ook met de Mexicaanse endemische soorten P. mirabilis, P. Ipomoeae en Phytophthora phaseoli, die genetisch nauwe P. infestans zijn die in dezelfde clade zijn opgenomen (Kroon et al., 2012). Als resultaat van deze analyses werd ondubbelzinnig aangetoond dat het wortelgedeelte van de fylogenetische boom van alle soorten van het geslacht Phytophthora die in de studie zijn opgenomen, behalve de hybride P. andina, tot Mexicaanse stammen behoort, en de migratiestroom heeft de richting Mexico - Andes, en niet omgekeerd, en het begin valt samen met de Europese kolonisatie van de Nieuwe Wereld (300-600 jaar geleden). De opkomst van de P. infestans-soort die gespecialiseerd is in het verslaan van aardappelen, vond dus plaats in het secundaire genetische centrum van de vorming van knolachtige solanaceuze planten, d.w.z. in Midden-Amerika.
Genoom van P. INFESTANS
In 2009 heeft een internationaal team van wetenschappers de sequentie bepaald van het volledige genoom van P infestans (Haas et al, 2009), waarvan de grootte 240 MB was. Dit is meerdere malen meer dan bij nauw verwante soorten P. sojae (95 Mb), die wortelrot van sojabonen veroorzaken, en P. Ramorum (65 Mb), die waardevolle boomsoorten als eik, beuk en enkele andere aantast. De verkregen gegevens toonden aan dat het genoom een groot aantal kopieën van herhaalde sequenties bevat - 74%. Het genoom bevat 17797 eiwitcoderende genen, waarvan het grootste deel genen zijn die betrokken zijn bij cellulaire processen, waaronder DNA-replicatie, transcriptie en translatie van eiwitten.
Een vergelijking van genomen van het geslacht Phytophthora onthulde een ongebruikelijke organisatie van het genoom, bestaande uit blokken van sequenties van geconserveerde genen, waarin de gendichtheid relatief hoog is en het gehalte aan herhaalde sequenties relatief laag, en individuele regio's met niet-geconserveerde gensequenties, met een lage gendichtheid en een hoog gehalte aan herhalende regio's. Conservatieve blokken zijn verantwoordelijk voor 70% (12440) van alle eiwitcoderende genen van P. infestans. Binnen conservatieve blokken bevinden genen zich meestal dicht bij elkaar met een gemiddelde intergene afstand van 604 bp. In gebieden tussen conservatieve blokken is de intergene afstand groter (3700 bp) vanwege een toename in de dichtheid van herhalende elementen. Snel evoluerende effector-secretoire genen bevinden zich in genarme regio's.
Sequentieanalyse van het P. Infestans-genoom toonde aan dat ongeveer een derde van het genoom tot transponeerbare elementen behoort. Het genoom van P. infestans bevat significant meer verschillende families van transposons dan andere bekende genomen. De meeste transposons van P. infestans behoren tot de zigeunerfamilie.
Een groot aantal specifieke genfamilies die betrokken zijn bij pathogenese, zijn geïdentificeerd in het genoom van P. infestans. Een aanzienlijk deel ervan codeert voor effector-eiwitten die de fysiologie van de waardplant veranderen en bijdragen aan de infectie ervan. Ze vallen in twee brede categorieën: apoplastische effectoren, die werken in de intercellulaire ruimtes (apoplasten), en cytoplasmatische effectoren, die cellen binnenkomen via haustoria. Apoplastische effectoren omvatten uitgescheiden hydrolytische enzymen zoals proteasen, lipasen en glycosylasen die plantencellen vernietigen; remmers van afweerenzymen van waardplanten en necrotiserende toxines zoals Nep1-achtige eiwitten (NPL's) en Pcf-achtige kleine cysteïnerijke eiwitten (SCR's).
P. infestans effectorgenen zijn talrijk en gewoonlijk groter dan niet-pathogene genen. De bekendste zijn de cytoplasmatische effectoren RXLR en Crinkler (CNR). De typische cytoplasmatische effectoren van oömyceten zijn RXLR-eiwitten. Alle tot dusver ontdekte RXLR-effectorgenen bevatten de amino-terminale groep Arg-XLeu-Arg, waarbij X een aminozuur is. Als resultaat van de studie werd gesuggereerd dat er 563 RXLR-genen in het P. infestans-genoom zitten, wat 60% meer is dan in P. sojae en P. ramorum. Ongeveer de helft van de RXLR-genen in het P. infestans-genoom is soortspecifiek. RXLR-effectoren hebben een grote verscheidenheid aan sequenties. Onder hen werden één grote en 150 kleine gezinnen geïdentificeerd. In tegenstelling tot het belangrijkste proteoom, bevinden de RXLR-effectorgenen zich meestal in genarme en herhalingsrijke gebieden van het genoom. De mobiele elementen die de dynamiek van deze regio's bepalen, vergemakkelijken de recombinatie in deze genen.
Cytoplasmatische CRN-effectoren werden oorspronkelijk geïdentificeerd in P. infestans-transcripten die coderen voor peptiden die necrose van plantenweefsel induceren. Sinds hun ontdekking is er weinig bekend over de familie van deze effectoren. Analyse van het P. Infestans-genoom onthulde een enorme familie van 196 CRN-genen, die significant groter is dan in P. sojae (100 CRN) en P. ramorum (19 CRN). Net als RXLR's zijn CRN's modulaire eiwitten en bestaan ze uit een sterk geconserveerd N-terminaal LFLAK-domein (50 aminozuren) en een aangrenzend DWL-domein met verschillende genen. De meeste CRN's (60%) hebben een signaalpeptide.
De mogelijkheid van verschillende CRN's om de cellulaire processen van de waardplant te verstoren is onderzocht. Bij de analyse van plantennecrose maakte de verwijdering van CRN2-eiwitten het mogelijk om het C-terminale gebied te identificeren dat bestaat uit 234 aminozuren (posities 173-407, DXG-domein) en celdood veroorzaakt. Analyse van P. infestans CRN-genen onthulde vier verschillende C-terminale regio's, die ook celdood in de plant veroorzaken. Deze omvatten de nieuw geïdentificeerde DC-domeinen (P. Infestans heeft 18 genen en 49 pseudogenen), evenals D2 (14 en 43) en DBF (2 en 1) domeinen die vergelijkbaar zijn met proteïnekinasen. Eiwitten van CRN-domeinen die in een plant tot expressie worden gebracht, worden geconserveerd (bij afwezigheid van signaalpeptiden) in een plantencel en stimuleren celdood door een intracellulair mechanisme. Nog eens 255 sequenties die CRN-domeinen bevatten, functioneren hoogstwaarschijnlijk niet als genen.
De toename in het aantal en de grootte van de RXLR- en CRN-effectorgenfamilies was vermoedelijk te wijten aan niet-allelische homologe recombinatie en genduplicatie. Ondanks het feit dat het genoom een groot aantal actieve mobiele elementen bevat, is er nog steeds geen direct bewijs voor de overdracht van effectorgenen.
Methoden die worden gebruikt bij de studie van de bevolkingsstructuur
De studie van de genetische structuur van populaties is momenteel gebaseerd op de analyse van zuivere culturen van de samenstellende stammen. De analyse van populaties zonder zuivere culturen te isoleren wordt ook uitgevoerd voor specifieke doeleinden, zoals bijvoorbeeld het bestuderen van de agressiviteit van een populatie of de aanwezigheid van stammen die resistent zijn tegen fungiciden daarin (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Bij dit type onderzoek worden speciale methoden gebruikt, waarvan de beschrijving buiten het bestek van deze review valt. Voor de vergelijkende analyse van stammen worden een aantal methoden gebruikt, zowel gebaseerd op de analyse van de DNA-structuur als op de studie van fenotypische manifestaties. Vergelijkende analyse van populaties heeft te maken met een groot aantal isolaten, wat bepaalde eisen stelt aan de gebruikte methoden. Idealiter zouden ze aan de volgende vereisten moeten voldoen (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- goedkoop zijn, gemakkelijk te implementeren, geen aanzienlijke tijdsinvestering vergen, gebaseerd zijn op algemeen beschikbare technologieën (bijvoorbeeld PCR);
- moet een voldoende groot aantal onafhankelijke codominante markeringskenmerken genereren;
- hebben een hoge reproduceerbaarheid;
- gebruik de minimale hoeveelheid te onderzoeken weefsel;
- specifiek zijn voor het substraat (de in de kweek aanwezige vervuiling mag de resultaten niet beïnvloeden);
- vereisen geen gebruik van gevaarlijke procedures en zeer giftige chemicaliën.
Helaas zijn er geen methoden die overeenkomen met alle bovenstaande parameters. Voor een vergelijkende studie van stammen in onze tijd worden methoden gebruikt die gebaseerd zijn op de analyse van fenotypische kenmerken: virulentie op aardappel- en tomatenrassen (aardappel- en tomatenrassen), paringstype, spectra van peptidase-iso-enzymen en glucose-6-fosfaat-isomerase, en op analyse van de DNA-structuur: lengtepolymorfisme restrictiefragment (RFLP), dat doorgaans wordt aangevuld met een hybridisatieprobe RG 57, analyse van microsatellietherhalingen (SSR en InterSSR), amplificatie met willekeurige primers (RAPD), amplificatie van restrictiefragmenten (AFLP), amplificatie met primers die homoloog zijn aan de sequenties van mobiele elementen (bijvoorbeeld Inter SINE PCR), bepaling van mitochondriaal DNA-haplotypes.
Korte beschrijvingen van methoden voor vergelijkende studie van stammen die worden gebruikt in het werk met P. Infestans
Fenotypische markereigenschappen
"Aardappel" races
"Aardappelrassen" zijn een veel onderzochte en gebruikte marker. "Eenvoudige aardappel" -rassen hebben één gen voor aardappelvirulentie, "complexe" - tenminste twee. Black et al. (1953), die alle beschikbare gegevens samenvatten, ontdekten dat het phytophthora-ras planten kan infecteren met het resistentiegen / genen die overeenkomen met het P. infestans virulentiegen / genen, en vonden rassen 1, 2, 3 en 4 die planten infecteren met respectievelijk genen R1, R2, R3 en R4, d.w.z. de interactie tussen de parasiet en de gastheer verloopt volgens het gen voor gen principe. Verder ontdekte Black, met de medewerking van Gallegly en Malcolmson, de resistentiegenen R5, R6, R7, R8, R9, R10 en R11, evenals de overeenkomstige rassen (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Er is een uitgebreide hoeveelheid gegevens over de raciale samenstelling van de ziekteverwekker uit verschillende regio's. Zonder deze gegevens in detail te analyseren, zullen we slechts een algemene trend aangeven: waar rassen met nieuwe resistentiegenen of hun combinaties werden gebruikt, was er aanvankelijk enige verzwakking van Phytophthora, maar toen verschenen en werden rassen met de overeenkomstige virulentiegenen geselecteerd en werden uitbraken van Phytophthora hervat. Specifieke virulentie tegen de eerste 4 resistentiegenen (R1-R4) werd zelden waargenomen in de collecties die werden verzameld vóór de introductie in de teelt van rassen met deze genen, maar het aantal virulente stammen nam sterk toe wanneer het pathogeen werd geparasiteerd op rassen die deze genen dragen. Genen 5-11 waren daarentegen vrij algemeen in collecties (Shaw, 1991).
Een onderzoek naar de verhouding tussen verschillende rassen tijdens het groeiseizoen, uitgevoerd aan het einde van de jaren tachtig, toonde aan dat aan het begin van de ontwikkeling van de ziekte klonen met een lage agressiviteit en 1980-1 virulentiegenen de overhand hebben in de populatie.
Verder neemt met de ontwikkeling van Phytophthora de concentratie van de oorspronkelijke klonen af en neemt het aantal "complexe" rassen met hoge agressiviteit toe. Het voorkomen van de laatste tegen het einde van het seizoen bereikt 100%. Bij het bewaren van knollen is er een afname van agressiviteit en verlies van individuele virulentiegenen. De dynamiek van kloonvervanging kan op verschillende manieren in verschillende variëteiten voorkomen (Rybakova & Dyakov, 1990). Onze studies in 2000-2010 toonden echter aan dat complexe rassen worden gevonden vanaf het allereerste begin van epifytotica onder stammen die zijn geïsoleerd uit zowel aardappelen als tomaten. Dit komt waarschijnlijk door een verandering in de populaties van P. Infestans in Rusland.
In 1988-1995 bereikte het voorkomen van "superrassen" met alle of bijna alle virulentiegenen in verschillende regio's 70-100%. Deze situatie werd bijvoorbeeld opgemerkt in Wit-Rusland, in de regio's Leningrad en Moskou, in Noord-Ossetië en in Duitsland (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Polityko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
"Tomaten" races
In tomatencultivars werden slechts 2 genen van resistentie tegen Phytophthora gevonden - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) en Ph2 (Al-Kherb, 1988). Net als bij de aardappelrassen vindt de interactie tussen tomaten en P. infestans gen per gen plaats. Het T0-ras infecteert rassen die geen resistentiegenen hebben (de meeste van de industrieel gebruikte rassen), het T1-ras infecteert rassen met het Ph1-gen (Ottawa) en het T2-ras infecteert rassen met het Ph2-gen.
In Rusland werd bijna uitsluitend T0 gevonden op aardappelen; T0 had de overhand op tomaten aan het begin van het seizoen, maar werd later vervangen door de T1-race (Dyakov et al., 1975, 1994). Na 2000 begon T1 op aardappelen in veel populaties voor te komen aan het begin van epifytotica. In de Verenigde Staten waren aardappelstammen niet-pathogeen voor tomaat, evenals rassen T0, T1 en T2, terwijl T1 en T2 de overhand hadden op tomaten (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Paringstype
Voor het onderzoek zijn teststammen (referentie) met bekende paringstypen - A1 en A2 vereist. Het testisolaat wordt met hen in paren geënt in petrischalen met haver-agarmedium. Na incubatie gedurende 10 dagen worden de platen onderzocht op de aan- of afwezigheid van oösporen in het medium in de contactzone van de stammen. Er zijn 4 opties: de stam behoort tot het A1-paringstype, als het oosporen vormt met de A2-tester, tot A2, als het oosporen vormt met de A1-tester, tot A1A2, als het oosporen vormt met beide testers, of steriel is (00), als het geen oosporen vormt zonder tester (de laatste twee groepen zijn zeldzaam).
Om de soorten paring sneller te kunnen bepalen, werden pogingen ondernomen om gebieden van het genoom te identificeren die geassocieerd zijn met het type paring, met als doel hun verder gebruik om het type paring te bepalen door middel van PCR. Een van de eerste succesvolle experimenten om een dergelijke site te identificeren, werd uitgevoerd door Amerikaanse onderzoekers (Judelson et al., 1995). Met behulp van de RAPD-methode waren ze in staat om de W16-regio te identificeren die geassocieerd is met het paringstype in de nakomelingen van de twee gekruiste isolaten, en een paar primers van 24 bp te ontwerpen voor de amplificatie ervan (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') en W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Na restrictie van het PCR-product met restrictie-enzym HaeIII was het mogelijk isolaten te scheiden met paringstypes Al en A1.
Een andere poging om PCR-markers te verkrijgen om de soorten paring te bepalen, werd ondernomen door Koreaanse onderzoekers (Kim, Lee, 2002). Ze identificeerden specifieke producten met behulp van de AFLP-methode. Als resultaat werd een paar primers PHYB-1 (voorwaarts) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') en PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3') ontwikkeld, waardoor selectieve amplificatie van het genoomgebied geassocieerd met het A2-paringstype mogelijk is. Vervolgens hebben ze dit werk voortgezet en primers 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, voorwaarts) en 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2) ontworpen, waardoor selectieve amplificatie van het Mat-A1-gebied kenmerkend is voor stammen met paringstype A1. Het gebruik van PCR-diagnostiek van paringstypes liet goede resultaten zien in de studie van P. infestans-populaties in Tsjechië (Mazakova et al., 2006), Tunesië (Jmour, Hamada, 2006) en andere regio's. In ons laboratorium (Mytsa, Elansky, niet gepubliceerd) werden 34 P. infestans-stammen geanalyseerd die waren geïsoleerd uit zieke aardappel- en tomatenorganen in verschillende regio's van Rusland (Kostroma, Ryazan, Astrakhan, Moskou oblasten). De resultaten van PCR-analyse met behulp van specifieke primers voor meer dan 90% vielen samen met de resultaten van de analyse van het paringstype volgens de traditionele methode op een voedingsbodem.
Tabel 1. Variabiliteit van resistentie binnen de Sib 1-kloon (Elansky et al., 2001)
Locatie monsterafname | Aantal geanalyseerde isolaten | Aantal gevoelige (S), zwak resistente (SR) en resistente (R) stammen, stuks (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkoetsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Yekaterinburg stad | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omsk regio | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Metalaxylresistentie als een populatiemarker
In de vroege jaren tachtig werden in verschillende regio's krachtige uitbraken van Phytophthora waargenomen, veroorzaakt door metalaxyl-resistente P. infestans-stammen. Aardappelkwekerijen hebben in veel landen aanzienlijke verliezen geleden (Dowley & O'Sullivan, 1980; Davidse et al., 1981; Derevyagina, 1983). Sindsdien is in veel landen van de wereld constant toezicht gehouden op het voorkomen van fenylamide-resistente stammen in P. infestans-populaties. Naast een praktische beoordeling van de vooruitzichten voor het gebruik van fenylamide-bevattende geneesmiddelen, het opbouwen van een systeem van beschermende maatregelen en het voorspellen van epifytotieën, is resistentie tegen deze geneesmiddelen een van de kenmerkende kenmerken geworden die veel worden gebruikt voor vergelijkende analyse van populaties van deze ziekteverwekker. Bij het gebruik van resistentie tegen metalaxyl in vergelijkende populatieonderzoeken moet echter rekening worden gehouden met het feit dat: 1991 - de genetische basis van resistentie nog niet precies is bepaald, 1 - resistentie tegen metalaxyl een selectief afhankelijke eigenschap is die kan variëren afhankelijk van het gebruik van fenylamiden, 2 - verschillende de mate van gevoeligheid voor metalaxylstammen binnen één klonale lijn (tabel. 3).
Spectra van isozymen
Isozymmarkers zijn meestal onafhankelijk van externe omstandigheden, vertonen Mendeliaanse overerving en zijn codominant, waardoor onderscheid kan worden gemaakt tussen homo- en heterozygoten. Het gebruik van eiwitten als genmarkers maakt het mogelijk om zowel grote reorganisaties van het genetisch materiaal te identificeren, waaronder chromosomale en genomische mutaties, als enkelvoudige aminozuursubstituties.
Elektroforetische studies van eiwitten hebben aangetoond dat de meeste enzymen in organismen voorkomen in de vorm van verschillende fracties die verschillen in elektroforetische mobiliteit. Deze fracties zijn het resultaat van het coderen van meerdere vormen van enzymen door verschillende loci (isozymen of isozymen) of door verschillende allelen van dezelfde locus (allozymen of allo-enzymen). Dat wil zeggen, isozymen zijn verschillende vormen van één enzym. Verschillende vormen hebben dezelfde katalytische activiteit, maar verschillen enigszins in substituties van enkele aminozuren in het peptide en de leiding. Dergelijke verschillen worden onthuld tijdens elektroforese.
In de studie van P. infestans-stammen worden de spectra van iso-enzymen van twee eiwitten, peptidase en glucose-6-fosfaatisomerase, gebruikt (dit enzym is monomorf in Russische populaties, daarom worden in dit werk geen onderzoeksmethoden gepresenteerd). Om ze te scheiden in isozymen in een elektrisch veld, worden proteïnepreparaten geïsoleerd uit de bestudeerde organismen aangebracht op een gelplaat die in een elektrisch veld is geplaatst. De diffusiesnelheid van individuele eiwitten in de gel hangt af van de lading en het molecuulgewicht; daarom wordt in een elektrisch veld het mengsel van eiwitten gescheiden in afzonderlijke fracties, die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van speciale kleurstoffen.
De studie van peptidase-iso-enzymen wordt uitgevoerd op cellulose-acetaat-, zetmeel- of polyacrylamidegels. Het handigst is de methode die is gebaseerd op het gebruik van celluloseacetaatgels vervaardigd door Helena Laboratories Inc. Er zijn geen grote hoeveelheden testmateriaal voor nodig, het stelt iemand in staat om contrasterende banden op de gel te verkrijgen na elektroforese voor beide enzymloci, en de implementatie ervan vereist geen grote tijd- en materiaalkosten (Fig. 2).
Een klein stukje mycelium wordt overgebracht in een microbuisje van 1,5 ml, er worden 1-2 druppels gedestilleerd water aan toegevoegd. Daarna wordt het monster gehomogeniseerd (bijvoorbeeld met een elektrische boormachine met een plastic opzetstuk geschikt voor een microbuisje) en gedurende 25 seconden op een centrifuge bij 13000 tpm gesedimenteerd. 8 μl uit elk microbuisje. het supernatant wordt overgebracht naar de applicatorplaat.
De celluloseacetaatgel wordt uit de buffercontainer verwijderd, tussen twee vellen filtreerpapier gedept en met de werklaag naar boven op de plastic basis van de applicator geplaatst. De oplossing van de plaat wordt 2-4 keer door de applicator op de gel overgebracht. De gel wordt overgebracht naar een elektroforesekamer,
Tabel 2. De samenstelling van de oplossing die wordt gebruikt voor het kleuren van celluloseacetaatgel bij de analyse van peptidase-iso-enzymen, een druppel verf (broomfenolblauw) wordt op de rand van de gel geplaatst.
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroxidase, 1000 U / ml 5 druppels
o-dianisidine, 4 mg / ml 8 druppels
MgCl2, 20 mg / ml 2 druppels
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 druppels
L-aminozuuroxidase, 20 u / ml 2 druppels
Elektroforese wordt gedurende 20 minuten uitgevoerd. bij 200 V. Na elektroforese wordt de gel overgebracht naar een schildertafel en gekleurd met een speciale verfoplossing (tabel 2). 10 ml 1,6% DIFCO-agar wordt voorlopig gesmolten in een magnetron, afgekoeld tot 60 ° C, waarna 2 ml agar wordt gemengd met een verfmengsel en op een gel wordt gegoten. Strepen verschijnen binnen 15-20 minuten. Het L-aminozuuroxidasereagens wordt toegevoegd onmiddellijk voordat de oplossing met gesmolten agar wordt gemengd.
In Russische populaties wordt de Pep 1-locus weergegeven door genotypen 100/100 en 92/100. Homozygoot 92/92 is uiterst zeldzaam (ongeveer 0,1%). Locus Rehr 2 wordt weergegeven door drie genotypen 100/100, 100/112 en 112/112, en alle 3 varianten komen vrij algemeen voor (Elanky en Smirnov, 2003, Fig. 2).
Genoomonderzoek
Beperkingsfragmentlengtepolymorfisme met daaropvolgende hybridisatie (RFLP-RG 57)
Het totale DNA wordt behandeld met het restrictie-enzym Eco R1, de DNA-fragmenten worden gescheiden door elektroforese in agarosegel. Nucleair DNA is erg groot en heeft veel repetitieve sequenties, waardoor het moeilijk is om de talrijke fragmenten die zijn verkregen door de werking van restrictie-enzymen direct te analyseren. Daarom worden de in de gel gescheiden DNA-fragmenten overgebracht naar een speciaal membraan en gebruikt voor hybridisatie met de RG 57-probe, die nucleotiden bevat die zijn gelabeld met radioactieve of fluorescerende labels. Deze sonde hybridiseert met zich herhalende genomische sequenties (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Na visualisatie van de resultaten van hybridisatie op een licht- of radioactief materiaal, wordt een multi-locus hybridisatieprofiel (fingerprinting) verkregen, vertegenwoordigd door 25-29 fragmenten (Forbes et al., 1998). Aseksuele (klonale) nakomelingen zullen dezelfde profielen hebben. Door de rangschikking van de banden op het elektroforetogram kan men de overeenkomsten en verschillen van de vergeleken organismen beoordelen.
Mitochondriaal DNA-haplotypes
In de meeste eukaryote cellen wordt mtDNA gepresenteerd in de vorm van een dubbelstrengs circulair DNA-molecuul, dat, in tegenstelling tot de nucleaire chromosomen van eukaryote cellen, semi-conservatief repliceert en niet geassocieerd is met eiwitmoleculen.
Van het mitochondriale genoom van P. infestans werd de sequentie bepaald, en een aantal werken werd gewijd aan de analyse van de lengtes van restrictiefragmenten (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Nadat Griffith en Shaw (1998) een eenvoudige en snelle methode hadden ontwikkeld om mtDNA-haplotypen te bepalen, werd deze marker een van de meest populaire in P. Infestans-onderzoeken. De essentie van de methode bestaat uit sequentiële amplificatie van twee mitochondriale DNA-fragmenten (uit het gemeenschappelijke genoom) met primers F2-R2 en F4-R4 (Tabel 3) en hun daaropvolgende beperking met restrictie-enzymen MspI (eerste fragment) en EcoR1 (tweede fragment). De methode stelt je in staat om 1 haplotypes te identificeren: Ia, IIa, Ib, IIb. Type II verschilt van type I door de aanwezigheid van een insert van 2 bp en een andere locatie van restrictielocaties in de P4- en P1881-regio's (Fig. 2).
Sinds 1996 werden onder de stammen die op het grondgebied van Rusland werden verzameld, alleen haplotypes Ia en IIa opgemerkt (Elansky et al., 2001, 2015). Ze kunnen worden geïdentificeerd na scheiding van de restrictieproducten met primer F2-R2 in een elektrisch veld (Fig. 4, 5). Typen mtDNA worden gebruikt bij vergelijkende analyse van stammen en populaties. In een aantal werken werden soorten mitochondriaal DNA gebruikt om klonale lijnen te isoleren en P. infestans-isolaten te paspoortiseren (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Met behulp van de PCR-RFLP-methode werd geconcludeerd dat mtDNA heterogeen is in dezelfde P. infestans-stam (Elansky en Milyutina, 2007). Amplificatiecondities: 1x (500 sec. 94 ° C), 40x (30 sec. 90 ° C, 30 sec. 52 ° C, 90 sec. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reactiemengsel: (20 μl): 0,2 U Taq DNA-polymerase, 1x 2,5 mM MgCl2-Taq-buffer, 0,2 mM elk dNTP, 30 pM primer en 5 ng van het geanalyseerde DNA, gedeïoniseerd water - tot 20 μl.
Beperking van het PCR-product wordt gedurende 4-6 uur bij een temperatuur van 37 ° C uitgevoerd. Restrictiemengsel (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x beperkingsbuffer (2 μl), gedeïoniseerd water (6 μl), PCR-product (10 μl).
Tabel 3. Primers gebruikt voor amplificatie van polymorfe mtDNA-gebieden
Locus | grondverf | Primer lengte en plaatsing | PCR-productlengte | Beperking |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Willekeurige primerversterking (RAPD)
Bij het uitvoeren van RAPD wordt één primer gebruikt (soms meerdere primers tegelijk) met een willekeurige nucleotidesequentie, meestal 10 nucleotiden lang, met een hoog gehalte (vanaf 50%) GC-nucleotiden en een lage annealingstemperatuur (ongeveer 35 ° C). Dergelijke primers "landen" op talrijke complementaire plaatsen in het genoom. Na amplificatie wordt een groot aantal amplicons verkregen. Hun aantal hangt af van de gebruikte primer (s) en de reactieomstandigheden (MgCl2-concentratie en gloeitemperatuur).
Visualisatie van amplicons wordt uitgevoerd door destillatie in polyacrylamide of agarosegel. Bij het uitvoeren van RAPD-analyse is het noodzakelijk om de zuiverheid van het geanalyseerde materiaal zorgvuldig te bewaken, omdat besmetting met andere levende objecten kan een aanzienlijke toename van het aantal artefacten veroorzaken, die vrij talrijk zijn bij de analyse van puur materiaal (Perez et al, 1998). Het gebruik van deze methode bij de studie van het P. infestans-genoom komt tot uiting in veel werken (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). De selectie van reactiecondities en primers (51 10-nucleotide primers werden bestudeerd) wordt gegeven in het artikel van Abu-El Samen et al., (2003).
Microsatelliet herhalingsanalyse (SSR)
Microsatellietherhalingen (eenvoudige sequentieherhalingen, SSR) zijn tandem herhalende korte sequenties van 1-3 (soms tot 6) nucleotiden die aanwezig zijn in de nucleaire genomen van alle eukaryoten. Het aantal opeenvolgende herhalingen kan variëren van 10 tot 100. Microsatellietloci komen vrij hoog voor en zijn min of meer gelijkmatig over het genoom verdeeld (Lagercrantz et al., 1993). Polymorfisme van microsatellietsequenties wordt geassocieerd met verschillen in het aantal herhalingen van het basismotief. Microsatellietmarkers zijn codominant, wat het mogelijk maakt ze te gebruiken voor het analyseren van de structuur van een populatie, het bepalen van verwantschap, migratiepaden van genotypen, enz. Naast andere voordelen van deze markers, moet men hun hoge polymorfisme, goede reproduceerbaarheid, neutraliteit en het vermogen om automatische analyse en evaluatie uit te voeren opmerken. Analyse van polymorfisme van microsatellietherhalingen wordt uitgevoerd door PCR-amplificatie met behulp van primers die complementair zijn aan unieke sequenties die microsatellietloci flankeren. Aanvankelijk werd de analyse uitgevoerd met de scheiding van de reactieproducten op een polyacrylamidegel. Later stelden de werknemers van het bedrijf Applied Biosystems voor om fluorescent gelabelde primers te gebruiken bij de detectie van reactieproducten met behulp van een automatische laserdetector (Diehl et al., 1990), en vervolgens standaard automatische DNA-sequencers (Ziegle et al., 1992). Door primers met verschillende fluorescerende kleurstoffen te labelen, kunt u meerdere markers tegelijk op één baan analyseren en dienovereenkomstig de productiviteit van de methode aanzienlijk verhogen en de nauwkeurigheid van de analyse vergroten.
De eerste publicaties over het gebruik van SSR-analyse voor de studie van P. infestans verschenen begin jaren 2000. (Knapova, Gisi, 2002). Niet alle door de auteurs voorgestelde markers vertoonden een voldoende mate van polymorfisme, maar twee ervan (4B en G11) werden opgenomen in de set van 12 SSR-markers voorgesteld door Lees et al. (2006) en vervolgens overgenomen door het Eucablight-onderzoeksnetwerk (www.eucablight .org) als standaard voor P. infestans. Een paar jaar later werd een studie gepubliceerd over het opzetten van een systeem voor multiplexanalyse van P. infestans-DNA op basis van acht SSR-markers (Li et al., 2010). Ten slotte, na het evalueren van alle eerder voorgestelde markers en het selecteren van de meest informatieve ervan, evenals het optimaliseren van primers, fluorescerende labels en amplificatieomstandigheden, presenteerde dezelfde groep auteurs een systeem voor eenstaps multiplexanalyse, inclusief 12 markers (tabel 4; Li et al. , 2013a). De primers die in dit systeem werden gebruikt, werden geselecteerd en gelabeld met een van de vier fluorescerende markers (FAM, VIC, NED, PET) zodat de bereiken van de allelgroottes van primers met dezelfde labels niet overlapten.
De auteurs hebben de analyse uitgevoerd op een PTC200-versterker (MJ Research, VS) met behulp van QIAGEN multiplex PCR-kits of QIAGEN Typeit Microsatellite PCR-kits. Het volume van het reactiemengsel was 12.5 μL. De amplificatiecondities waren als volgt: voor QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 sec), 58 ° C (90 sec), 72 ° C (60 sec), 72 ° C (20 min); voor QIAGEN Type-it microsatelliet PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 sec), 58 ° C (90 sec), 72 ° C (20 sec), 60 ° C (30 min).
Scheiding en visualisatie van PCR-producten werd uitgevoerd met behulp van een ABI3730 automatische capillaire DNA-analysator (Applied Biosystems).
Tabel 4. Kenmerken van 12 standaard SSR-markers die worden gebruikt voor de genotypering van P. Infestans (Li et al., 2013a)
Naam | Aantal allelen | Maatbereik allelen (bp) | Primers |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | F: FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCCGAATTCATTTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | F: FAM-TCTTGTTCGAGTATGCCACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: HUISDIER-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Een voorbeeld van het visualiseren van de analyseresultaten wordt getoond in Fig. 6. De resultaten werden geanalyseerd met behulp van GeneMapper 3.7-software door de verkregen gegevens te vergelijken met de gegevens van bekende isolaten. Om de interpretatie van de analyseresultaten te vergemakkelijken, is het noodzakelijk om in elk onderzoek 1-2 referentie-isolaten met een bekend genotype op te nemen.
De voorgestelde onderzoeksmethode is getest op een aanzienlijk aantal veldmonsters, waarna de auteurs protocollen hebben gestandaardiseerd tussen laboratoria van twee organisaties, The James Hutton Institute (VK) en Wageningen University & Research (Nederland), die, samen met de mogelijkheid om standaard FTA-kaarten te gebruiken voor vereenvoudigde Door het verzamelen en verzenden van P. infestans DNA-monsters konden we spreken over de mogelijkheid van commercieel gebruik van deze ontwikkeling. Bovendien maakte een snelle en nauwkeurige methode voor het genotyperen van P. infestans-isolaten met behulp van multiplex SSR-analyse het mogelijk om gestandaardiseerde studies uit te voeren van populaties van deze ziekteverwekker op wereldschaal, en de creatie van een wereldwijde database over Phytophthora in het kader van het Eucablight-project (www.eucablight.org), inclusief , inclusief de resultaten van microsatellietanalyse, maakte het mogelijk om de opkomst en verspreiding van nieuwe genotypen over de hele wereld te volgen.
Geamplificeerd restrictiefragmentlengtepolymorfisme (AFLP). AFLP (amplified fragment length polymorphism) is een technologie voor het genereren van willekeurige moleculaire markers met behulp van specifieke primers. Bij AFLP wordt DNA behandeld met een combinatie van twee restrictie-enzymen. Specifieke adapters worden geligeerd aan de plakkerige uiteinden van de restrictiefragmenten.
Deze fragmenten worden vervolgens geamplificeerd met behulp van primers die complementair zijn aan de adaptersequentie en restrictieplaats, en die bovendien een of meer willekeurige basen dragen aan hun 3'-uiteinden. De reeks verkregen fragmenten hangt af van restrictie-enzymen en willekeurig geselecteerde nucleotiden aan de 3'-uiteinden van de primers (Vos et al., 1995). AFLP - genotypering wordt gebruikt om snel de genetische variatie van verschillende organismen te bestuderen.
Een gedetailleerde beschrijving van de methode wordt gegeven in de werken van Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Er is veel werk verricht door Chinese onderzoekers om de resolutie van AFLP- en SSR-methoden te vergelijken. De fenotypische en genotypische kenmerken van 48 P. infestans-isolaten verzameld in vijf regio's van Noord-China werden bestudeerd. De AFLP-spectra onthulden acht verschillende DNA-genotypen, in tegenstelling tot de SSR-genotypen, waarvoor geen diversiteit werd gevonden (Guo et al., 2008).
Amplificatie met primers die homoloog zijn aan de sequenties van mobiele elementen
Markers afgeleid van sequenties van retrotransposons zijn erg handig voor genetische mapping, de studie van genetische diversiteit en evolutionaire processen (Schulman, 2006). Als primers worden gemaakt om de stabiele sequenties van bepaalde mobiele elementen aan te vullen, is het mogelijk om de genoomregio's daartussen te versterken. In studies naar de veroorzaker van Phytophthora werd de methode om delen van het genoom te amplificeren met behulp van een primer die complementair is aan de kernsequentie van het SINE-retropazon (Short Interspersed Nuclear Elements) met succes toegepast (Lavrova en Elansky, 2003). Met behulp van deze methode werden zelfs verschillen aan het licht gebracht bij aseksuele nakomelingen van één isolaat. In dit verband werd geconcludeerd dat de inter-SINE-PCR-methode zeer specifiek is en dat de bewegingssnelheid van SINE-elementen in het Phytophthora-genoom hoog is.
In het genoom van P. infestans zijn 12 families van korte retrotransposons (SINE's) geïdentificeerd; de soortverspreiding van korte retrotransposons werd onderzocht, er werden elementen (SINE's) geïdentificeerd die alleen in het genoom van P. infestans voorkomen (Lavrova, 2004).
Kenmerken van de toepassing van methoden voor vergelijkende studie van stammen in populatiestudies
Bij het plannen van een onderzoek moet men de doelen die het nastreeft duidelijk begrijpen en de juiste methoden gebruiken. Sommige methoden maken het dus mogelijk om een groot aantal onafhankelijke markeringsborden te genereren, maar hebben tegelijkertijd een lage reproduceerbaarheid en zijn sterk afhankelijk van de gebruikte reagentia, reactieomstandigheden en de vervuiling van het testmateriaal. Daarom is het in elke studie van een groep stammen nodig om verschillende standaard (referentie) isolaten te gebruiken, maar zelfs in dit geval zijn de resultaten van verschillende experimenten erg moeilijk te combineren.
Deze groep methoden omvat RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Na amplificatie wordt een groot aantal DNA-fragmenten van verschillende grootte verkregen. Het is raadzaam om dergelijke technieken te gebruiken als het nodig is om verschillen vast te stellen tussen nauw verwante stammen (ouder-nakomelingen, wildtype-mutanten, enz.), Of in gevallen waarin een gedetailleerde analyse van een klein monster vereist is. De AFLP-methode wordt dus veel gebruikt bij het genetisch in kaart brengen van P. infestans (van der Lee et al., 1997) en bij intrapopulatieonderzoeken (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Dergelijke methoden zijn niet geschikt om te gebruiken bij het maken van databases met stammen, omdat het is praktisch onmogelijk om de boekhouding van resultaten te uniformeren bij het uitvoeren van analyses in verschillende laboratoria.
Ondanks de schijnbare eenvoud en snelheid van uitvoering (DNA-isolatie zonder goede zuivering, amplificatie, visualisatie van de resultaten), vereist deze groep methoden het gebruik van een speciale methode om de resultaten te documenteren: destillatie in polyacrylamidegel met gelabelde (radioactief of luminescerende) primers en daaropvolgende blootstelling aan licht of radioactief materiaal. Conventionele beeldvorming van ethidiumbromide-agarosegel is over het algemeen niet geschikt voor deze methoden omdat een groot aantal DNA-fragmenten van verschillende grootte kunnen samensmelten.
Andere methoden maken het daarentegen mogelijk om een klein aantal kenmerken te genereren met hun zeer hoge reproduceerbaarheid. Deze groep omvat de studie van mitochondriaal DNA-haplotypes (slechts twee haplotypes Ia en IIa worden genoteerd in Rusland), paringstype (de meeste isolaten zijn onderverdeeld in 2 soorten: A1 en A2, zelfvruchtbare SF worden zelden gevonden) en peptidase-isozym-spectra (twee loci Pep1 en Pep2 , bestaande uit elk twee isozymen) en glucose-6-fosfaat-isomerase (in Rusland is er geen variabiliteit in deze eigenschap, hoewel significant polymorfisme wordt opgemerkt in andere landen van de wereld). Het is raadzaam om deze functies te gebruiken bij het analyseren van collecties en het samenstellen van regionale en wereldwijde databases. In het geval van de analyse van isozymen en haplotypes van mitochondriaal DNA, is het mogelijk om helemaal zonder standaardstammen te doen, terwijl bij de analyse van paringstypes twee testisolaten met bekende paringstypes nodig zijn.
Reactiecondities en reagentia kunnen alleen het contrast van het product op het elektroforetogram beïnvloeden; de manifestatie van artefacten in dit soort onderzoeken is onwaarschijnlijk.
Momenteel worden de meeste populaties in het Europese deel van Rusland vertegenwoordigd door stammen van beide soorten paring (tabel 6), waaronder isolaten met type Ia en IIa van mitochondriaal DNA (andere soorten mtDNA die in de wereld zijn gevonden, zijn na 1993 niet in Rusland gevonden). De spectra van peptidase-isozymen worden weergegeven door twee genotypen op de Pep1-locus (100/100, 92/92 en heterozygoot 92/100, en het 92/92-genotype is uiterst zeldzaam (<0,3%)) en door twee genotypen op de Pep 2-locus (100/100 , 112/112 en heterozygoot 100/112, waarbij het genotype 112/112 minder vaak voorkomt dan 100/100, maar ook vrij vaak).
Er was geen variabiliteit in het spectrum van isozymen van glucose-6-fosfaatisomerase na 1993 (het verdwijnen van de klonale lijn US-1); alle bestudeerde isolaten hadden het 100/100 genotype (Elansky en Smirnov, 2002).
De derde groep methoden maakt het mogelijk om een voldoende groep onafhankelijke markertekens met hoge reproduceerbaarheid te verkrijgen. Tegenwoordig omvat deze groep de RFLP-RG57-sonde, die 25-29 DNA-fragmenten van verschillende groottes produceert. RFLP-RG57 kan zowel worden gebruikt bij het analyseren van monsters als bij het samenstellen van databases. Deze methode is echter veel duurder dan de vorige, het is tijdrovend en vereist een voldoende grote hoeveelheid sterk gezuiverd DNA. Daarom wordt de onderzoeker gedwongen om het volume van het geteste materiaal te beperken.
De ontwikkeling van RFLP-RG57 in de vroege jaren 90 van de vorige eeuw heeft de populatieonderzoeken naar de veroorzaker van Phytophthora aanzienlijk geïntensiveerd. Het werd de basis van de methode op basis van de selectie en analyse van "Clonal-lijnen" (zie hieronder). Samen met RFLP-RG57 worden paringstype, DNA-fingerprinting (RFLP-RG57-methode), spectra van peptidase en glucose-6-fosfaatisomerase-iso-enzymen en mitochondriaal DNA-type gebruikt om klonale lijnen te identificeren. Dankzij hem werd aangetoond dat al., 1994), de vervanging van oude populaties door nieuwe (Drenth et al., 1993, Sujkowski et al., 1994, Goodwin et al., 1995a), onthulde klonale lijnen die in veel landen van de wereld heersen. Studies van Russische stammen die deze methode gebruikten, toonden een hoog genotypisch polymorfisme van de stammen van het Europese deel en monomorfisme van de populaties van de Aziatische delen van Rusland en het Verre Oosten (Elansky et al, 2001). En nu blijft deze methode de belangrijkste in populatiestudies van P. infestans. De brede verspreiding ervan wordt echter belemmerd door de vrij hoge kosten en arbeidsintensiteit bij de uitvoering.
Een andere veelbelovende techniek die zelden wordt gebruikt in P. infestans-onderzoeken is microsatellietherhaling (SSR) -analyse. Momenteel wordt deze methode veel gebruikt om klonale lijnen te isoleren. Voor de analyse van stammen werden fenotypische markereigenschappen zoals de aanwezigheid van virulentiegenen in aardappelvariëteiten (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) en tomaat veel gebruikt (en worden nog steeds gebruikt). Inmiddels hebben genen voor virulentie voor aardappelrassen hun waarde verloren als merkerkenmerken voor populatiestudies vanwege het verschijnen van het maximale (of bijna) aantal virulentiegenen in de overgrote meerderheid van isolaten. Tegelijkertijd wordt het T1-virulentiegen voor tomatencultivars die het corresponderende Ph1-gen dragen, nog steeds met succes gebruikt als kenmerkende eigenschap (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
In veel werken wordt resistentie tegen fungiciden gebruikt als kenmerkende eigenschap. Deze eigenschap is ongewenst om te gebruiken in populatiestudies vanwege het vrij gemakkelijke verschijnen van resistentiemutaties in klonale lijnen na de toepassing van metalaxyl- (of mefenoxam-) bevattende fungiciden in het veld. Er werden bijvoorbeeld significante verschillen in het resistentieniveau aangetoond binnen de Sib1-klonale lijn (Elansky et al., 2001).
Het paringstype, het peptidase-iso-enzymspectrum, het mitochondriale DNA-type, RFLP-RG57, SSR zijn dus de geprefereerde markereigenschappen voor het creëren van databanken en het labelen van stammen in collecties. Als u een beperkt aantal monsters wilt vergelijken, kunt u AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR gebruiken als het nodig is om het maximale aantal markeringsfuncties toe te passen (tabel 5). Houd er echter rekening mee dat deze methoden slecht reproduceerbaar zijn en dat het bij elk afzonderlijk experiment (amplificatie-elektroforese-cyclus) nodig is om verschillende referentie-isolaten te gebruiken.
Tabel 5. Vergelijking van verschillende onderzoeksmethoden voor stammen P. infestans
criterium | TC | Isofer politie | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Hoeveelheid informatie | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproduceerbaarheid | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Mogelijkheid van artefacten | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
kosten | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Arbeidsintensiteit | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Analyse snelheid ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Opmerking: H - laag, C - gemiddeld, B - hoog; НС * - de arbeidsintensiteit is laag bij gebruik van agarosegel of automatisch
genotyper, medium - door destillatie in polyacrylamidegel met gelabelde primers,
** - de tijd die wordt besteed aan het kweken van mycelium voor DNA-isolatie niet meegerekend.
Bevolkingsstructuur
Klonale lijnen
Bij afwezigheid van recombinatie of de onbeduidende bijdrage ervan aan de populatiestructuur, bestaat de populatie uit een bepaald aantal klonen, waartussen genetische uitwisselingen uiterst zeldzaam zijn.
In dergelijke populaties is het informatiever om niet de frequenties van individuele genen te bestuderen, maar de frequenties van genotypen die een gemeenschappelijke oorsprong hebben (klonale lijnen of klonale lijnen) en alleen verschillen door puntmutaties. Populatiestudies van de Phytophthora-pathogeen en de analyse van klonale lijnen zijn aanzienlijk versneld sinds de komst van de RFLP-RG57-methode in de vroege jaren 90 van de vorige eeuw. Samen met RFLP-RG57 worden het paringstype, spectra van peptidase en glucose-6-fosfaatisomerase-iso-enzymen en het mitochondriale DNA-type gebruikt om klonale lijnen te identificeren. De kenmerken van de meest voorkomende klonale lijnen worden weergegeven in Tabel 6.
Kloon US-1 domineerde de populaties overal tot het einde van de jaren tachtig, waarna het werd vervangen door andere klonen en verdween uit Europa en Noord-Amerika. Het wordt nu gevonden in het Verre Oosten (Filippijnen, Taiwan, China, Japan, Korea, Koh et al., 80, Mosa et al, 1994), in Afrika (Oeganda, Kenia, Rwanda, Goodwin et al, 1993, Vega-Sanchez et al. al., 1994; Ochwo et al., 2000) en in Zuid-Amerika (Ecuador, Brazilië, Peru, Forbes et al., 2002; Goodwin et al., 1997). Alleen in Australië zijn er geen stammen geïdentificeerd die tot de US-1994-lijn behoren. Blijkbaar kwamen P. infestans-isolaten naar Australië met een nieuwe migratiegolf (Goodwin, 1).
Kloon US-6 migreerde eind jaren zeventig van Noord-Mexico naar Californië en veroorzaakte daar een epidemie in aardappelen en tomaten na 70 jaar zonder ziekte. Vanwege zijn hoge agressiviteit verplaatste het de US-32-kloon en begon het te domineren aan de westkust van de Verenigde Staten (Goodwin et al., 1a).
De genotypen US-7 en US-8 werden in 1992 in de Verenigde Staten ontdekt en werden al in 1994 op grote schaal verspreid in de Verenigde Staten en Canada. Tijdens één veldseizoen is kloon US-8 in staat om kloon US-1 bijna volledig te verdringen in aardappelpercelen die aanvankelijk waren geïnfecteerd met beide klonen bij een gelijke concentratie (Miller en Johnson, 2000).
Klonen BC-1 tot BC-4 zijn in British Columbia geïdentificeerd in een klein aantal isolaten van Goodwin et al., 1995b). Kloon US-11 verspreidde zich wijd in de Verenigde Staten en verdrong US-1 in Taiwan. Klonen JP-1 en EC-1, samen met kloon US-1, komen veel voor in respectievelijk Japan en Ecuador (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 is een kloon die in Rusland heerste over een uitgestrekt gebied van de regio Moskou tot Sakhalin. In de regio Moskou werd het in 1993 ontdekt en sommige populaties in het veld bestonden voornamelijk uit stammen van deze klonale lijn, zeer resistent tegen metalaxyl. Na 1993 nam de prevalentie van deze kloon significant af. Buiten de Oeral werd in 1997-1998 overal SIB-1 gevonden, met uitzondering van het Khabarovsk-gebied (de kloon SIB-2 is daar wijdverbreid). De ruimtelijke scheiding van klonen met verschillende soorten paring sluit het seksuele proces in Siberië en het Verre Oosten uit. In de regio Moskou wordt de bevolking, in tegenstelling tot Siberië, vertegenwoordigd door vele klonen; bijna elk isolaat heeft een uniek multilocusgenotype (Elansky et al., 2001, 2015). Deze diversiteit kan niet alleen worden verklaard door de invoer van schimmelsoorten uit verschillende delen van de wereld met geïmporteerd zaadmateriaal. Aangezien beide soorten paring voorkomen in de populatie, is het mogelijk dat de diversiteit ook te wijten is aan recombinatie. In British Columbia wordt dus het ontstaan van genotypen BC-2, BC-3 en BC-4 verondersteld als gevolg van hybridisatie van klonen BC-1 en US-6 (Goodwin et al., 1995b). Het is mogelijk dat hybride soorten worden aangetroffen in Moskou-populaties. Stammen MO-4, MO-8 en MO-11 die heterozygoot zijn voor de PEP-locus kunnen bijvoorbeeld hybriden zijn tussen de stammen MO-12, MO-21, MO-22, met het A2-paringstype en homozygoot voor één allel van de PEP-locus en de stam MO-8, met het A1-paringstype en homozygoot voor het andere allel van de locus. En als dit zo is, en in moderne populaties van P. infestans is er een tendens tot een toename van de rol van het seksuele proces, dan zal de informatiewaarde van de analyse van multilocus klonen afnemen (Elansky et al., 2001, 2015).
Variatie in klonale lijnen
Tot de jaren 90 van de 20e eeuw was de clonale lijn US-1 wijdverspreid in de wereld. De meeste veld- en regionale populaties bestonden uitsluitend uit stammen met het US-1-genotype. Er werden echter ook verschillen tussen de isolaten waargenomen, hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt door een mutatieproces. Mutaties traden op in zowel nucleair als mitochondriaal DNA en beïnvloedden onder meer de mate van resistentie tegen fenylamidegeneesmiddelen en het aantal virulentiegenen. Lijnen die door mutaties van de oorspronkelijke genotypen verschillen, worden aangegeven door extra nummers achter de punt die volgt op de naam van het oorspronkelijke genotype (bijvoorbeeld de mutantlijn US-1.1 van de klonale lijn US-1). Vingerafdruk-DNA-lijnen US-1.5 en US-1.6 bevatten accessoirelijnen van verschillende afmetingen (Goodwin et al., 1995a, 1995b); de klonale lijn US-6.3 verschilt ook van US-6 door één accessoirelijn (Goodwin, 1997, Tabel 7).
Bij het bestuderen van mitochondriaal DNA werd gevonden dat alleen type 1b mitochondriaal DNA wordt gevonden in de klonale lijn US-1 (Carter et al., 1990). In de studie van stammen van deze klonale afstamming uit Peru en de Filippijnen werden echter isolaten gevonden waarvan de mitochondriale DNA-typen verschilden van 1b in de aanwezigheid van inserties en deleties (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Tabel 6. Multilocus genotypen van enkele P. infestans klonale lijnen
Naam | Paringstype | Isozymen | DNA-vingerafdrukken | MtDNA-type | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Opmerking: * - geen gegevens.
Tabel 7. Multilocus genotypen en hun mutante lijnen
Naam | Paringstype | | DNA-vingerafdrukken (RG57) | Opmerkingen | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Origineel genotype 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutatie in PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutatie in RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutatie in RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutatie in RG57 en PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutatie in RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Origineel genotype 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutatie in PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutatie in RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutatie in RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutatie in RG57 en PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutatie in RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Origineel genotype 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutatie in RG57 |
Er zijn ook veranderingen in de spectra van isozymen. In de regel worden ze veroorzaakt door de afbraak van een organisme dat aanvankelijk heterozygoot voor dit enzym was in homozygote. In 1993 identificeerden we op tomatenfruit een stam met kenmerken die typisch zijn voor US-1: RG57-vingerafdrukken, mitochondriaal DNA-type en 86/100 genotype voor glucose-6-fosfatizomerase, maar het was homozygoot (100/100) voor de eerste peptidase-locus in plaats van een 92/100 heterozygoot typisch voor deze klonale lijn. We noemden het genotype van deze stam MO-17 (tabel 6). De mutantlijnen US-1.1 en US-1.4 verschillen ook van US-1 door mutaties op de eerste peptidase-locus (Tabel 7).
Mutaties die leiden tot veranderingen in het aantal virulentiegenen bij aardappel- en tomatenrassen komen vrij vaak voor. Ze werden opgemerkt onder de isolaten van de klonale lijn US-1 in populaties uit Nederland (Drenth et al., 1994), Peru (Goodwin et al., 1995a), Polen (Sujkowski et al., 1991), Noord-Noord-Amerika (Goodwin et al., ., 1995b). Verschillen in het aantal aardappelvirulentiegenen werden ook opgemerkt tussen isolaten van de klonale lijnen US-7 en US-8 in Canada en de Verenigde Staten (Goodwin et al., 1995a), onder isolaten van de SIB-1-lijn in het Aziatische deel van Rusland (Elansky et al, 2001 ).
Isolaten met sterke verschillen in de mate van resistentie tegen fenylamidegeneesmiddelen werden geïdentificeerd in monoklonale veldpopulaties, die allemaal behoorden tot de klonale lijn Sib-1 (Elansky et al, 2001, tabel 1). Bijna alle stammen van de klonale lijn US-1 zijn zeer gevoelig voor metalaxyl; zeer resistente isolaten van deze lijn werden echter geïsoleerd in de Filippijnen (Koh et al., 1994) en in Ierland (Goodwin et al., 1996).
Moderne populaties van P. infestans
Midden-Amerika (Mexico)
De P. infestans-populatie in Mexico verschilt duidelijk van andere wereldbevolking, wat voornamelijk te wijten is aan haar historische positie. Talrijke studies van deze populatie en verwante P. infestans-soorten van de clade Phytophthora, evenals lokale soorten van het geslacht Solanum, leidden tot de conclusie dat de evolutie van de ziekteverwekker in het centrale deel van Mexico plaatsvond samen met de evolutie van waardplanten en werd geassocieerd met seksuele recombinatie (Grünwald, Flier , 2005). Beide soorten paren zijn vertegenwoordigd in de populatie, en in gelijke verhoudingen, en de aanwezigheid van oösporen in de bodem, op planten en knollen van aardappelen en in het wild verwante Solanum-soorten bevestigt de aanwezigheid van een seksueel proces in de populatie (Fernández-Pavía et al., 2002). Recente studies van de Toluca-vallei en zijn omgeving (het vermoedelijke centrum van oorsprong van de ziekteverwekker) bevestigden de hoge genetische diversiteit van de lokale populatie van P. infestans (134 multilocus-genotypen in een steekproef van 176 stalen) en de aanwezigheid van verschillende gedifferentieerde subpopulaties in de regio (Wang et al., 2017). De factoren die bijdragen aan deze differentiatie zijn de ruimtelijke verdeling van subpopulaties die kenmerkend zijn voor de hooglanden van centraal Mexico, verschillen in teeltomstandigheden en aardappelvariëteiten die worden gebruikt in valleien en bergen, en de aanwezigheid van wilde tubereuze Solanum-soorten die als alternatieve gastheren kunnen dienen (Fry et al. ., 2009).
Er moet echter worden opgemerkt dat de populaties van P. infestans in Noord-Mexico meer klonaal van aard zijn en meer lijken op Noord-Amerikaanse populaties, wat erop kan wijzen dat dit de nieuwe genotypen zijn (Fry et al., 2009).
Noord-Amerika
De Noord-Amerikaanse populaties van P. infestans hebben altijd een zeer eenvoudige structuur gehad en hun klonale karakter werd lang voordat microsatellietanalyse werd gebruikt, vastgesteld. Tot 1987 domineerde de klonale lijn US-1 in de Verenigde Staten en Canada (Goodwin et al., 1995). Halverwege de jaren zeventig, toen op metalaxyl gebaseerde fungiciden verschenen, begon deze kloon te worden vervangen door andere, meer resistente genotypen die vanuit Mexico migreerden (Goodwin et al., 70). Eind jaren 1998. het US-90-genotype verving volledig het US-8-genotype in de Verenigde Staten en werd de dominante klonale lijn op aardappelen (Fry et al., 1; Fry et al., 2009). De situatie was anders met tomaten, die constant verschillende klonale lijnen bevatten, en hun samenstelling veranderde van jaar tot jaar (Fry et al., 2015).
In 2009 brak in de Verenigde Staten op tomaten een grootschalige epidemie van Phytophthora uit. Kenmerkend voor deze pandemie was het bijna gelijktijdig ontstaan ervan op veel plaatsen in het noordoosten van de Verenigde Staten, en het bleek verband te houden met de massale verkoop van geïnfecteerde tomatenzaailingen in grote tuincentra (Fry et al., 2013). De oogstverliezen waren enorm. Microsatellietanalyse van de aangetaste monsters onthulde dat de pandemische stam behoorde tot het paringstype van de klonale lijn US-22 A2. In 2009 bereikte het aandeel van dit genotype in de Amerikaanse populatie van P. infestans 80% (Fry et al., 2013). In de daaropvolgende jaren nam het aandeel van agressieve genotypen US-23 (voornamelijk op tomaten) en US-24 (op aardappelen) gestaag toe in de populatie, maar na 2011 daalde het detectiepercentage van US-24 aanzienlijk, en tot op heden is ongeveer 90% van de pathogenenpopulatie in De Verenigde Staten worden vertegenwoordigd door het genotype US-23 (Fry et al., 2015).
In Canada, net als in de Verenigde Staten, eind jaren '90. het dominante genotype US-1 werd verdrongen door US-8, waarvan de dominante posities tot 2008 ongewijzigd bleven. In Canada waren er ernstige Phytophthora-epidemieën in verband met de verkoop van geïnfecteerde tomatenzaailingen, maar deze werden veroorzaakt door de genotypen US-2009 en US-2010 (Kalischuk et al., 23). De duidelijke geografische differentiatie van deze genotypen was opmerkelijk: US-8 domineerde de westelijke provincies van Canada (2012%), terwijl US-23 de oostelijke provincies domineerde (68%). In de daaropvolgende jaren verspreidde US-8 zich naar de oostelijke regio's; in het algemeen nam zijn aandeel in de bevolking echter lichtjes af tegen de achtergrond van het verschijnen van genotypen US-83 en US-23 in het land (Peters et al., 22). Tot op heden heeft de US-24 een dominante positie in heel Canada; US-2014 is aanwezig in British Columbia, terwijl US-23 en US-8 aanwezig zijn in Ontario (Peters, 23).
De Noord-Amerikaanse populaties van P. infestans zijn dus voornamelijk klonale lijnen. In de afgelopen 40 jaar heeft het aantal gedetecteerde klonale genotypen 24 bereikt. Ondanks het feit dat stammen van beide soorten paring in de populatie aanwezig zijn, blijft de kans op het verschijnen van nieuwe genotypen als gevolg van seksuele recombinatie vrij laag. Desalniettemin zijn in de afgelopen 20 jaar verschillende gevallen van het verschijnen van kortstondige recombinante populaties geregistreerd (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), en in één geval was het resultaat van kruising het genotype US-11 , dat jarenlang in Noord-Amerika verankerd was (Gavino et al., 2000). Tot 2009 waren veranderingen in de structuur van populaties geassocieerd met de opkomst van nieuwe, agressievere genotypen met hun daaropvolgende migratie en verplaatsing van voorheen dominante voorgangers. Wat is er gebeurd in 2009-2010 In de VS en Canada toonden epifytotica voor het eerst aan dat in het tijdperk van globalisering uitbraken van de ziekte geassocieerd kunnen worden met de actieve verspreiding van nieuwe genotypen bij de verkoop van geïnfecteerd plantmateriaal.
Zuid-Amerika
Tot voor kort waren studies van de Zuid-Amerikaanse populaties van P. infestans noch regelmatig, noch grootschalig. Het is bekend dat de structuur van deze populaties vrij eenvoudig is en 1-5 klonale lijnen per land omvat (Forbes et al., 1998). Dus tegen 1998 waren de genotypen US-1 (Brazilië, Chili) BR-1 (Brazilië, Bolivia, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ecuador, Colombia, Peru en Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 en AR-5 (Argentinië), PE-3 en PE-7 (Zuid-Peru). Paring type A2 was aanwezig in Brazilië, Bolivia en Argentinië en werd niet gevonden buiten de Boliviaans-Peruaanse grens in het gebied van het Titicacameer, waarachter het EC-1 A1 genotype domineerde in de Andes. Voor tomaten bleef US-1 het dominante genotype in heel Zuid-Amerika.
De situatie hield min of meer aan in de jaren 2000. Een belangrijk punt was de ontdekking van een nieuwe klonale lijn EC-2 van het A2-type op wilde verwanten van aardappelen (S. brevifolium en S. tetrapetalum) in de noordelijke Andes (Oliva et al., 2010). Fylogenetische studies hebben aangetoond dat deze lijn niet volledig identiek is aan P. infestans, hoewel hij er nauw mee verwant is, in dit verband werd voorgesteld om hem te beschouwen, evenals een andere lijn, EC-3, geïsoleerd uit de tomatenboom S. betaceum die groeit in de Andes, een nieuwe soort genaamd P. andina; de status van deze soort (een onafhankelijke soort of een hybride van P. infestans met een nog onbekende lijn) is echter nog onduidelijk (Delgado et al., 2013).
Momenteel zijn alle Zuid-Amerikaanse populaties van P. infestans klonaal. Ondanks de aanwezigheid van beide soorten paring, zijn er geen recombinante populaties geïdentificeerd. Op tomaten is het US-1-genotype alomtegenwoordig, blijkbaar verdrongen van aardappelen door lokale stammen, waarvan de exacte oorsprong nog onbekend is. In Brazilië, Bolivia en Uruguay is het BR-1-genotype aanwezig; in Peru zijn er, samen met US-1 en EC-1, verschillende andere lokale genotypen. In de Andes wordt de dominante positie behouden door de klonale lijn EC-1, waarvan de relatie met de recent ontdekte P. andina onbekend blijft. De enige "onstabiele" plek waar voor de periode 2003-2013. er waren significante veranderingen in de bevolking, werd Chili (Acuña et al., 2012), waar in 2004-2005. de pathogene populatie werd gekenmerkt door resistentie tegen metalaxyl en een nieuw mitochondriaal DNA-haplotype (Ia in plaats van het eerder aanwezige Ib). 2006 tot 2011 in de populatie domineerde genotype 21 (volgens SSR), waarvan het aandeel 90% bereikte, waarna de palm overging op genotype 20, waarvan de frequentie van voorkomen in de komende twee jaar op ongeveer 67% werd gehouden (Acuña, 2015).
Europa
In de geschiedenis van Europa zijn er ten minste twee migratiegolven van P. infestans vanuit Noord-Amerika: in de 1e eeuw. (HERB-1) en begin 70e eeuw (US-1). De alomtegenwoordige distributie van metalaxylbevattende fungiciden in de jaren XNUMX. leidde tot de verplaatsing van het dominante genotype US-XNUMX en de vervanging ervan door nieuwe genotypen. Als gevolg hiervan werden in de meeste landen van West-Europa populaties van de ziekteverwekker voornamelijk vertegenwoordigd door verschillende klonale lijnen.
Het gebruik van microsatellietanalyse voor de analyse van pathogene populaties maakte het mogelijk om ernstige veranderingen aan het licht te brengen die zich in West-Europa hebben voorgedaan in 2005-2008. In 2005 werd een nieuwe klonale lijn ontdekt in het VK, genaamd 13_A2 (of 'Blue 13') en gekenmerkt door het A2-paringstype , hoge agressiviteit en resistentie tegen fenylamiden (Shaw et al., 2007). Hetzelfde genotype werd gevonden in monsters die in 2004 in Nederland en Noord-Frankrijk waren verzameld, wat suggereerde dat het vanuit continentaal Europa naar het VK was gemigreerd, mogelijk met pootaardappelen (Cooke et al., 2007). De studie van het genoom van vertegenwoordigers van deze klonale lijn toonde een hoge mate van polymorfisme van de sequentie (in 2016 bereikte het aantal subklonale variaties 340) en een aanzienlijke mate van variatie in het niveau van genexpressie, incl. effectorgenen tijdens plantinfectie (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Deze kenmerken, samen met de langere duur van de biotrofe fase, zouden een verhoogde agressiviteit van 13_A2 kunnen veroorzaken en het vermogen ervan om zelfs aardappelrassen te infecteren die resistent zijn tegen Phytophthora.
In de komende jaren verspreidde het genotype zich snel over de landen van Noordwest-Europa (Groot-Brittannië, Ierland, Frankrijk, België, Nederland, Duitsland) met de gelijktijdige verplaatsing van de voorheen dominante genotypen 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Volgens de website www.euroblight.net bedroeg het aandeel van 13_A2 in de bevolking van deze landen 60-80% en meer; de aanwezigheid van dit genotype is ook geregistreerd in sommige landen van Oost- en Zuid-Europa. Echter, in 2009-2012. 13_A2 verloor zijn dominante posities in Groot-Brittannië en Frankrijk en gaf toe aan de 6_A1-lijn (8_A1 in Ierland), en in Nederland en België werd deze gedeeltelijk vervangen door genotypen 1_A1, 6_A1 en 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Tot op heden is ongeveer 70% van de West-Europese populatie van P. infestans monoklonaal. Volgens de website www.euroblight.net zijn de dominante genotypen in de landen van Noordwest-Europa (VK, Frankrijk,
Nederland, België) blijven, ongeveer in gelijke verhoudingen, 13_A2 en 6_A1, en dit laatste komt praktisch niet voor buiten de gespecificeerde regio (met uitzondering van Ierland), maar heeft al minstens 58 subklonen (Cooke, 2017). Variaties 13_A2 zijn in opmerkelijke aantallen aanwezig in Duitsland, en worden ook sporadisch waargenomen in de landen van Midden- en Zuid-Europa. Genotype 1_A1 maakt een aanzienlijk deel uit van de populaties van België en gedeeltelijk Nederland en Frankrijk. Genotype 8_A1 heeft zich in de Europese bevolking gestabiliseerd op het niveau van 3-6%, met uitzondering van Ierland, waar het zijn leidende positie behoudt en is verdeeld in twee subklonen (Stellingwerf, 2017). Ten slotte werd in 2016 een toename opgemerkt in de frequentie van het voorkomen van nieuwe genotypen 36_A2 en 37_A2, voor het eerst geregistreerd in 2013-2014; Tot op heden worden deze genotypen gevonden in Nederland en België en gedeeltelijk in Frankrijk en Duitsland, evenals in het zuidelijke deel van Groot-Brittannië (Cooke, 2017). Ongeveer 20-30% van de West-Europese bevolking wordt elk jaar vertegenwoordigd door unieke genotypen.
In tegenstelling tot West-Europa werden tegen de tijd dat het 13_A2-genotype verscheen, de populaties van Noord-Europa (Zweden, Noorwegen, Denemarken, Finland) niet vertegenwoordigd door klonale lijnen, maar door een groot aantal unieke genotypen (Brurberg et al.,
2011). Tijdens de periode van actieve verspreiding van 13_A2 in West-Europa werd de aanwezigheid van dit genotype in Scandinavië pas opgemerkt in 2011, toen het voor het eerst werd ontdekt in Noord-Jutland (Denemarken), waar voornamelijk industriële aardappelrassen worden geteeld met het actieve gebruik van metalaxylbevattende fungiciden (Nielsen et al., 2014). Volgens www.euroblight.net werd genotype 13_A2 in 2014 ook gedetecteerd in verschillende monsters uit Noorwegen en Denemarken en in verschillende Noorse monsters in 2016; bovendien werd in 2013 de aanwezigheid van genotype 6_A1 in een kleine hoeveelheid opgemerkt in Finland. De belangrijkste reden voor het falen van 13_A2 en andere klonale lijnen bij de verovering van Scandinavië wordt beschouwd als de klimatologische verschillen tussen deze regio en de landen van West-Europa.
Naast het feit dat koele zomers en koude winters het voortbestaan bevorderen van niet zozeer vegetatief mycelium als wel oösporen (Sjöholm et al., 2013), draagt het bevriezen van de bodem in de winter (wat meestal niet voorkomt in warmere landen van West-Europa) bij aan de synchronisatie van oösporenkieming en aanplant. aardappelen, wat hun rol als bron van primaire infectie vergroot (Brurberg et al., 2011). Er moet ook worden opgemerkt dat in noordelijke omstandigheden de ontwikkeling van infectie door oösporen de ontwikkeling van tubereuze infectie overtreft, wat uiteindelijk de dominantie van nog agressievere, maar later ontwikkelde klonale lijnen voorkomt (Yuen, 2012). De structuur van de meest bestudeerde populaties van P. infestans in de landen van Oost-Europa (Polen, de Baltische staten) lijkt sterk op die in Scandinavië.
Beide soorten paring zijn hier ook aanwezig, en de overgrote meerderheid van de genotypen bepaald door SSR-analyse zijn uniek (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Net als in Noord-Europa had de distributie van klonale lijnen (voornamelijk van het 13_A2-genotype) praktisch geen invloed op de lokale populaties van het pathogeen, die een hoge mate van diversiteit behouden met de afwezigheid van uitgesproken dominante lijnen.
De aanwezigheid van 13_A2 wordt af en toe waargenomen in velden met commerciële aardappelrassen. In Rusland ontwikkelt de situatie zich op een vergelijkbare manier. Microsatellietanalyse van P. infestans-isolaten verzameld in 2008-2011 in 10 verschillende regio's van het Europese deel van Rusland, vertoonden een hoge mate van genotypische diversiteit en een volledig gebrek aan toevalligheden met Europese klonale lijnen (Statsyuk et al., 2014). Enkele jaren later toonde een studie van P. infestans-monsters verzameld in de regio Leningrad in 2013-2014 significante verschillen tussen hen en de genotypen uit deze regio die in de vorige studie werden geïdentificeerd. In beide onderzoeken werden geen West-Europese genotypen gevonden (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
De hoge genetische diversiteit van de Oost-Europese populaties van P. infestans en de afwezigheid van dominante klonale lijnen daarin kan verschillende redenen hebben. Ten eerste dragen, net als in Noord-Europa, de klimatologische omstandigheden van de beschouwde landen bij aan de vorming van oösporen als primaire infectiebron (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). Ten tweede wordt een aanzienlijk deel van de aardappelen die in deze landen worden geproduceerd, geteeld op kleine particuliere boerderijen, vaak omgeven door bossen of andere obstakels voor het vrije verkeer van besmettelijk materiaal (Chmielarz et al., 2014). Aardappelen die onder dergelijke omstandigheden worden geteeld, worden in de regel praktisch niet met chemicaliën behandeld en de rassenkeuze is gebaseerd op hun resistentie tegen Phytophthora, d.w.z. er is geen selectieve druk voor agressiviteit en resistentie tegen metalaxyl, waardoor resistente genotypen, zoals 13_A2, voordelen hebben ten opzichte van andere genotypen (Chmielarz et al., 2014). Ten slotte, vanwege de kleine omvang van de percelen, oefenen hun eigenaren meestal geen vruchtwisseling uit en telen ze jarenlang aardappelen op dezelfde plaats, wat bijdraagt aan de accumulatie van een genetisch divers inoculum (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Azië
Tot voor kort bleef de structuur van P. infestans-populaties in Azië relatief slecht begrepen. Het was bekend dat het voornamelijk wordt weergegeven door klonale lijnen, en het effect van seksuele recombinatie op het ontstaan van nieuwe genotypen is erg klein. Dus bijvoorbeeld in 1997-1998. In het Aziatische deel van Rusland (Siberië en het Verre Oosten) werd de populatie van ziekteverwekkers vertegenwoordigd door slechts drie genotypen met een overwicht van het SIB-1-genotype (Elansky et al., 2001). De aanwezigheid van klonale pathogeenlijnen is aangetoond in landen als China, Japan, Korea, de Filippijnen en Taiwan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). De clonale lijn US-1 domineerde eind jaren 90 - begin 2000 over een groot gebied van Azië. bijna overal begonnen te worden vervangen door andere genotypen, die op hun beurt plaats maakten voor nieuwe. In de meeste gevallen werden veranderingen in de structuur en samenstelling van populaties in Aziatische landen geassocieerd met de migratie van nieuwe genotypen van buitenaf. Dus in Japan, met uitzondering van het JP-3-genotype, hebben alle andere Japanse genotypen die na US-1 verschenen (JP-1, JP-2, JP-3) min of meer bewezen externe oorsprong (Akino et al., 2011) ... In China zijn er momenteel drie belangrijke pathogeenpopulaties met een duidelijke geografische indeling; Er is geen of een zeer zwakke genstroom tussen deze populaties (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Genotype 13_A2 verscheen op het grondgebied van China in de zuidelijke provincies (Yunnan en Sichuan) in 2005-2007 en in 2012-1014. werd ook gezien in het noordoosten van het land (Li et al., 2013b). In India verscheen 13_A2 vermoedelijk op hetzelfde moment als in China, hoogstwaarschijnlijk met geïnfecteerde pootaardappelen (Chowdappa et al., 2015), en in 2009-2010. veroorzaakte een ernstige epifytische ziekte van Phytophthora op tomaat in het zuiden van het land, waarna het zich verspreidde naar aardappelen en in 2014 een uitbraak van Phytophthora veroorzaakte in West-Bengalen, wat leidde tot de ondergang en zelfmoord van veel lokale boeren (Fry, 2016).
Afrika
Tot 2008-2010 er zijn geen systematische studies van P. infestans in Afrikaanse landen uitgevoerd. Momenteel zijn de Afrikaanse populaties van P. infestans in twee groepen te verdelen, en deze indeling houdt duidelijk verband met het feit dat pootaardappelen uit Europa worden geïmporteerd.
In Noord-Afrika, dat actief pootaardappelen uit Europa importeert, is het A2-paringstype breed vertegenwoordigd in bijna alle regio's, wat een theoretische mogelijkheid biedt voor het ontstaan van nieuwe genotypen als gevolg van seksuele recombinatie (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Bovendien wordt in Algerije de aanwezigheid van genotypen 13_A2, 2_A1 en 23_A1 opgemerkt met een uitgesproken dominantie van de eerste, evenals een geleidelijke afname van het aandeel unieke genotypen om het verdwijnen te voltooien (Rekad et al., 2017). In tegenstelling tot de rest van de regio wordt in Tunesië (met uitzondering van het noordoosten van het land) de pathogene populatie voornamelijk vertegenwoordigd door het A1-paringstype (Harbaoui et al., 2014).
De klonale lijn NA-01 is hier dominant. Over het algemeen is het aandeel van klonale lijnen in de populatie slechts 43%. In Oost- en Zuidelijk Afrika, waar de importvolumes van zaden uitermate klein zijn (Fry et al., 2009), wordt P. infestans vertegenwoordigd door slechts twee klonale A1-type lijnen, US-1 en KE-1, en de laatste vervangt actief de eerste op aardappelen ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Tot op heden hebben beide genotypen een opmerkelijk aantal subklonale variaties.
Australië
De eerste melding van Phytophthora op aardappelen in Australië dateert uit 1907, en de eerste epifytotie, vermoedelijk veroorzaakt door zware regenval in de zomermaanden, vond plaats in 1909-1911. (Drenth et al., 2002). Over het algemeen heeft Phytophthora echter geen significante economische betekenis voor het land. Sporadische uitbraken van Phytophthora, veroorzaakt door weersomstandigheden die zorgen voor een hoge luchtvochtigheid, komen niet vaker voor dan eens in de 5-7 jaar en zijn voornamelijk gelokaliseerd in het noorden van Tasmanië en centraal Victoria. In verband met het bovenstaande zijn publicaties gewijd aan de studie van de structuur van de Australische populatie van P. infestans praktisch afwezig. De laatst beschikbare informatie is van 1998-2000. (Drenth et al., 2002). Volgens de auteurs was de bevolking van de staat Victoria een klonale lijn US-1.3, die indirect de migratie van dit genotype uit de Verenigde Staten bevestigde. De Tasmaanse exemplaren werden geclassificeerd als AU-3, anders dan de genotypen die op dat moment in andere delen van de wereld aanwezig waren.
Kenmerken van de ontwikkeling van Phytophthora in Rusland
In Europa wordt een infectie die is geïntroduceerd met zieke zaadknollen, oösporen die in de grond overwinterden, en zoösporangia die door de wind zijn meegebracht uit planten die zijn gekweekt uit overwinterde knollen op velden van vorig jaar ('vrijwillige' planten) of op hopen geruimde planten, beschouwd als het primaire inoculum op aardappelen. bladwijzer voor opslag van knollen. Hiervan worden planten die op hopen afgedankte knollen worden gekweekt, beschouwd als de gevaarlijkste infectiebron. daar is het aantal gekiemde knollen vaak aanzienlijk, en zoosporangia kan van hen over grote afstanden worden vervoerd. De rest van de bronnen (oösporen, "vrijwillige" planten) zijn niet zo gevaarlijk, omdat Het is niet gebruikelijk om planten vaker dan eens in de 3-4 jaar op dezelfde velden te kweken. Infectie door zieke zaadknollen is ook minimaal dankzij een goed zaadkwaliteitscontrolesysteem.
Over het algemeen is de hoeveelheid inoculum in Europese populaties beperkt, en daarom is de toename van de epidemie vrij langzaam en kan deze met succes worden bestreden met behulp van chemische fungicide preparaten. De belangrijkste taak in Europese omstandigheden is de strijd tegen infectie in de fase waarin de massale verspreiding van zoosporangia uit aangetaste planten begint.
In Rusland is de situatie radicaal anders. Het grootste deel van de aardappel- en tomatenoogst wordt verbouwd in kleine privétuinen; beschermende maatregelen worden er helemaal niet op uitgevoerd, of fungicide behandelingen worden in onvoldoende mate uitgevoerd en beginnen na het verschijnen van Phytophthora op de toppen. Als gevolg hiervan fungeren particuliere moestuinen als de belangrijkste bron van infectie, van waaruit zoosporangia door de wind naar commerciële aanplant worden gedragen. Dit wordt bevestigd door onze directe waarnemingen in de regio's Moskou, Bryansk, Kostroma, Ryazan: schade aan planten in privétuinen wordt al voor het begin van de fungicidenbehandelingen van commerciële aanplantingen waargenomen. Vervolgens wordt de epidemie in grote velden tegengegaan door het gebruik van fungicide preparaten, terwijl in privétuinen een snelle ontwikkeling van Phytophthora plaatsvindt.
In het geval van onjuiste of "budgettaire" behandelingen van commerciële aanplant, verschijnen er foci van Phytophthora in de velden; later ontwikkelen ze zich actief, waarbij ze steeds grotere gebieden bestrijken (Elansky, 2015). Infecties in privétuinen hebben een aanzienlijke impact op epidemieën in commerciële velden. In alle aardappelteeltregio's van Rusland is het gebied dat wordt ingenomen door aardappelen in privétuinen meerdere keren groter dan het totale oppervlak van velden van grote producenten. In een dergelijke omgeving kunnen particuliere moestuinen worden beschouwd als een wereldwijde inoculumbron voor commerciële velden. Laten we proberen die eigenschappen te identificeren die kenmerkend zijn voor de genotypen van soorten in privétuinen.
Het planten van niet-pootgoed en de quarantainecontrole van consumptieaardappelen, tomatenzaden verkregen van dubieuze buitenlandse producenten, langdurige teelt van aardappelen en tomaten op dezelfde gebieden, onjuiste behandelingen met fungiciden of hun volledige afwezigheid leiden tot ernstige epifytieën in de privésector, waarvan het resultaat gratis is kruising, hybridisatie en de vorming van oösporen in privétuinen. Als resultaat wordt een zeer hoge genotypische diversiteit van de ziekteverwekker waargenomen, terwijl bijna elke stam uniek is in zijn genotype (Elansky et al., 2001, 2015). Door pootaardappelen van verschillende genetische oorsprong te planten, is het onwaarschijnlijk dat er klonale lijnen zullen ontstaan die gespecialiseerd zijn om een bepaalde variëteit aan te vallen. De stammen die in een dergelijk geval worden geselecteerd, onderscheiden zich door hun veelzijdigheid in relatie tot de aangetaste variëteiten, de meeste hebben een bijna maximaal aantal virulentiegenen. Dit verschilt sterk van het systeem van "klonale lijnen" dat typisch is voor grote velden van landbouwbedrijven met een correct geïnstalleerd systeem van bescherming tegen Phytophthora. "Klonale lijnen" (wanneer alle stammen van de Phytophthora-ziekteverwekker in het veld worden vertegenwoordigd door een of meer genotypen) zijn alomtegenwoordig in landen waar de aardappelteelt uitsluitend wordt uitgevoerd door grote boerderijen: de VS, Nederland, Denemarken, enz. aardappelteelt is er ook een hogere genotypische diversiteit in privétuinen. Aan het einde van de 20e eeuw waren "klonale lijnen" wijdverspreid in de Aziatische delen van Rusland en het Verre Oosten (Elansky et al., 2001), wat blijkbaar te wijten is aan het gebruik van dezelfde aardappelsoorten uitsluitend voor opplant. Onlangs begon de situatie in deze regio's ook te veranderen naar een toename van de genotypische diversiteit van populaties.
Het ontbreken van intensieve behandelingen met fungicide preparaten heeft nog een ander, direct gevolg: er is geen ophoping van resistente stammen in de tuinen. Onze resultaten tonen inderdaad aan dat metalaxyl-resistente stammen significant minder vaak in privétuinen worden aangetroffen dan in commerciële aanplant.
De nabijheid van aardappel- en tomatenplantages, typisch voor privétuinen, vergemakkelijkt de migratie van stammen tussen deze gewassen, waardoor in het laatste decennium onder de uit aardappelen geïsoleerde stammen het aandeel stammen dat het gen draagt voor resistentie tegen cherrytomaatvariëteiten (T1), voorheen alleen kenmerkend voor tomaat "stammen. Stammen met het T1-gen zijn in de meeste gevallen zeer agressief tegen zowel aardappelen als tomaten.
In de afgelopen jaren begon Phytophthora op tomaat in veel gevallen eerder te verschijnen dan op aardappelen. Tomatenzaailingen kunnen worden aangetast door oösporen in de grond, of oösporen die aanwezig zijn in tomatenzaden of eraan hechten (Rubin et al., 2001). In de afgelopen 15 jaar is er een groot aantal goedkope verpakte zaden, voornamelijk geïmporteerd, in winkels verschenen, waarvan de meeste kleine producenten zijn overgestapt. De zaden kunnen stammen bevatten met genotypen die kenmerkend zijn voor de groeiregio's. In de toekomst worden deze genotypen opgenomen in het seksuele proces in privétuinen, wat leidt tot de opkomst van volledig nieuwe genotypen.
Zo kan worden gesteld dat privétuinen een mondiale "smeltkroes" zijn waarin, als gevolg van de uitwisseling van genetisch materiaal, bestaande genotypen worden verwerkt en volledig nieuwe genotypes verschijnen. Bovendien vindt hun selectie plaats onder omstandigheden die sterk verschillen van die voor aardappelen op grote boerderijen: de afwezigheid van schimmelwerende pers, uniformiteit van de rassen van aanplant, de overheersing van planten die worden aangetast door verschillende vormen van virale en bacteriële infectie, nabijheid van tomaten en wilde nachtschade, actieve kruising en vorming van oosporen, de mogelijkheid zodat oösporen het komende jaar als infectiebron kunnen fungeren.
Dit alles leidt tot een zeer hoge genotypische diversiteit aan populaties in de achtertuin. Onder epifytotische omstandigheden verspreidt Phytophthora zich zeer snel in moestuinen en komen er enorme hoeveelheden sporen vrij, die naar nabijgelegen commerciële aanplant vliegen. Nadat ze echter de commerciële velden zijn betreden met het juiste systeem van landbouwtechnologie en chemische bescherming, hebben de sporen die zijn binnengekomen praktisch geen gelegenheid om epifytotica in het veld te initiëren, wat te wijten is aan de afwezigheid van klonale lijnen die resistent zijn tegen fungiciden en gespecialiseerd zijn in de gekweekte variëteit.
Een andere bron van primair inoculum kunnen zieke knollen zijn die gevangen zitten in commerciële zaailingen. Deze knollen werden in de regel geteeld op velden met goede landbouwtechnologie en intensieve chemische bescherming. De genotypen van de isolaten die de knollen aantasten, zijn aangepast aan de ontwikkeling van hun eigen ras. Deze soorten zijn aanzienlijk gevaarlijker voor commerciële aanplant dan inoculum afkomstig uit privétuinen. De resultaten van onze onderzoeken ondersteunen deze veronderstelling ook. Populaties geïsoleerd uit grote velden met goed geleide chemische bescherming en goede landbouwtechnologie verschillen niet in hoge genotypische diversiteit. Vaak zijn dit meerdere klonale lijnen die zeer agressief zijn.
Stammen van commercieel zaadmateriaal kunnen populaties in moestuinen binnendringen en betrokken zijn bij de processen die daarin plaatsvinden. In een moestuin zal hun concurrentievermogen echter veel lager zijn dan in een commercieel gebied, en binnenkort zullen ze ophouden te bestaan in de vorm van een klonale lijn, maar hun genen kunnen worden gebruikt in de "tuin" -populatie.
De infectie die zich ontwikkelt op "vrijwillige" planten en op hopen geruimde knollen tijdens het oogsten is niet zo relevant voor Rusland, omdat In de belangrijkste aardappelteeltgebieden van Rusland wordt diepe bevriezing van de winterbodem waargenomen en ontwikkelen zich zelden planten van knollen die in de grond hebben overwinterd. Bovendien, zoals onze experimenten aantonen, overleeft de Phytophthora-ziekteverwekker niet bij negatieve temperaturen, zelfs niet op knollen die hun levensvatbaarheid hebben behouden. In de droge zone, waar de teelt van vroege aardappelen wordt beoefend, is Phytophthora vrij zeldzaam vanwege het droge en hete groeiseizoen.
Zo observeren we momenteel de verdeling van P. infestans-populaties in "veld" en "tuin" populaties. In de afgelopen jaren zijn er echter processen waargenomen die hebben geleid tot de convergentie en interpenetratie van genotypen uit deze populaties.
Onder hen valt een algemene toename van de geletterdheid van kleine producenten op, de opkomst van betaalbare kleine pakjes pootaardappelen, de verspreiding van fungicide preparaten in kleine verpakkingen en het verlies van de angst voor 'chemie' bij de bevolking.
Er doen zich situaties voor wanneer, dankzij de krachtige activiteit van één leverancier, hele dorpen worden beplant met zaadknollen van dezelfde variëteit en voorzien van kleine verpakkingen van dezelfde pesticiden. Aangenomen mag worden dat aardappelen van hetzelfde ras op commerciële aanplant in de buurt zullen worden aangetroffen.
Aan de andere kant promoten sommige handelsondernemingen van pesticiden “goedkope” chemische behandelingsprogramma's. In dit geval wordt het aantal aanbevolen behandelingen onderschat en worden de goedkoopste fungiciden aangeboden, en ligt de nadruk niet op het voorkomen van de ontwikkeling van Phytophthora tot aan het maaien van de toppen, maar op enige vertraging in epifytie om de opbrengst te verhogen. Dergelijke schema's zijn economisch verantwoord bij het telen van consumptieaardappelen uit laagwaardig pootgoed, waarbij in principe geen sprake is van een hoge opbrengst. In dit geval, in tegenstelling tot de tuinpopulaties, draagt de genivelleerde genetische achtergrond van de aardappel echter bij aan de selectie van specifieke fysiologische rassen, die erg gevaarlijk zijn voor deze variëteit.
Over het algemeen lijken de tendensen in de richting van de convergentie van "tuin" en "veld" methoden voor de aardappelteelt ons nogal gevaarlijk. Om de negatieve gevolgen ervan, zowel in de thuis- als in de commerciële sector, te voorkomen, is het nodig om zowel het assortiment pootaardappelen als het assortiment fungiciden dat in kleinverpakking aan particuliere eigenaren wordt aangeboden, te beheersen, evenals het traceren van aardappelbeschermingsregelingen en het gebruik van fungiciden in de commerciële sector.
In de particuliere sector is er een intensieve ontwikkeling van niet alleen Phytophthora, maar ook Alternaria. De meeste eigenaren van particuliere boerderijen nemen geen speciale maatregelen om te beschermen tegen Alternaria, aangezien ze de ontwikkeling van Alternaria aanzien voor de natuurlijke verwelking van het gebladerte of de ontwikkeling van Phytophthora. Daarom, met de massale ontwikkeling van Alternaria op vatbare rassen, kunnen huishoudelijke percelen dienen als een bron van inoculum voor commerciële aanplant.
Mechanismen van variabiliteit
Mutatieproces
Aangezien het optreden van mutaties een willekeurig proces is dat verloopt met een lage frequentie, hangt het optreden van mutaties op elke locus af van de frequentie van mutatie van deze locus en de grootte van de populatie. Bij het bestuderen van de frequentie van mutaties van P. infestans-stammen wordt meestal het aantal kolonies bepaald dat op selectieve voedingsbodems wordt gekweekt na behandeling met chemische of fysische mutagene agentia. Zoals kan worden gezien uit de gegevens in Tabel 8, kan de mutatiefrequentie van dezelfde stam op verschillende loci verschillende ordes van grootte verschillen. De hoge frequentie van mutaties in resistentie tegen metalaxyl kan een van de redenen zijn voor de accumulatie van stammen die in de natuur resistent zijn tegen metalaxyl.
De frequentie van spontane of geïnduceerde mutaties, berekend op basis van laboratoriumexperimenten, komt niet altijd overeen met de processen die plaatsvinden in natuurlijke populaties, om de volgende redenen:
1. Bij asynchrone kernsplijtingen is het onmogelijk om de frequentie van mutaties per nucleaire generatie te schatten. Daarom geven de meeste experimenten alleen direct informatie over de frequentie van mutaties, zonder onderscheid te maken tussen twee mutatiegebeurtenissen en één gebeurtenis na mitose.
2. Eenstaps-mutaties verminderen gewoonlijk de balans van het genoom, waardoor, samen met het verwerven van een nieuwe eigenschap, de algemene fitheid van het organisme afneemt. De meeste van de experimenteel verkregen mutaties hebben een verminderde agressiviteit en worden niet geregistreerd in natuurlijke populaties. De correlatiecoëfficiënt tussen de mate van resistentie van P. infestans-mutanten tegen fenylamidefungiciden en de groeisnelheid op een kunstmatig medium was dus gemiddeld (-0,62) en de resistentie tegen fungiciden en agressiviteit op aardappelbladeren (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), wat duidt op de lage fitness van de mutanten. Mutaties in resistentie tegen dimethomorf gingen ook gepaard met een sterke afname van de levensvatbaarheid (Bagirova et al., 2001).
3. De meeste spontane en geïnduceerde mutaties zijn recessief en manifesteren zich niet fenotypisch in experimenten, maar vormen een verborgen reserve van variabiliteit in natuurlijke populaties. Mutante stammen die in laboratoriumexperimenten zijn geïsoleerd, dragen dominante of semi-dominante mutaties (Kulish en Dyakov, 1979). Blijkbaar verklaart nucleaire diploïdie onsuccesvolle pogingen om onder invloed van UV-straling mutanten te verkrijgen die virulent zijn op voorheen resistente variëteiten (McKee, 1969). Volgens berekeningen van de auteur kunnen dergelijke mutaties voorkomen met een frequentie van minder dan 1: 500000. De overgang van recessieve mutaties naar een homozygote, fenotypisch uitgedrukte toestand kan optreden als gevolg van seksuele of aseksuele recombinatie (zie hieronder). Maar zelfs in dit geval kan de mutatie worden gemaskeerd door de dominante allelen van de wild-type kernen in het cenotische (meerkernige) mycelium en alleen fenotypisch gefixeerd tijdens de vorming van eenkernige zoösporen.
Tabel 8. Frequentie van P. infestans-mutaties op groeiremmende stoffen onder invloed van nitrosomethylureum (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
samenstelling | Mutatiefrequentie |
Oxytetracycline | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S. | X 7,2 10-8 |
Streptomycine | 8,3 x10-8 |
Trichothecin | 1,8 10 x-8 |
Cycloheximide | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
De omvang van de populatie speelt ook een doorslaggevende rol bij het optreden van spontane mutaties. In zeer grote populaties, waarin het aantal cellen N> 1 / a, waarbij a de mutatiesnelheid is, is mutatie niet langer een willekeurig verschijnsel (Kvitko, 1974).
Uit berekeningen blijkt dat bij een gemiddelde aantasting van een aardappelveld (35 plaatsen per plant) dagelijks 8x1012 sporen op één hectare worden gevormd (Dyakov en Suprun, 1984). Blijkbaar bevatten dergelijke populaties alle mutaties die zijn toegestaan door het type uitwisseling op elke locus. Zelfs een zeldzame mutatie, die optreedt met een frequentie van 10-9, zal worden verworven door duizend individuen op de miljoenen die op een hectare aardappelveld leven. Voor mutaties die met een hogere frequentie voorkomen (bijvoorbeeld 10-6), kunnen in een dergelijke populatie dagelijks verschillende gepaarde mutaties voorkomen (gelijktijdig op twee loci), d.w.z. het mutatieproces zal recombinatie vervangen.
Migraties
Voor P. infestans zijn er twee soorten migratie bekend: het verkleinen van afstanden (binnen een aardappelveld of aangrenzende velden) door verspreiding van zoosporangia door luchtstromingen of regensproeier, en tot grote afstanden - met het planten van knollen of vervoerde tomatenvruchten. De eerste methode zorgt voor de uitbreiding van de focus van de ziekte, de tweede - het creëren van nieuwe haarden op plaatsen die ver verwijderd zijn van de primaire.
De verspreiding van infectie met tomatenknollen en fruit draagt niet alleen bij aan het ontstaan van de ziekte op nieuwe plaatsen, maar is ook de belangrijkste bron van genetische diversiteit in populaties. In de regio Moskou worden aardappelen geteeld, meegenomen uit verschillende regio's van Rusland en West-Europa. Tomatenvruchten worden meegenomen uit de zuidelijke regio's van Rusland (regio Astrakhan, regio Krasnodar, Noord-Kaukasus). Tomatenzaden, die ook als infectiebron kunnen dienen (Rubin et al., 2001), worden ook geïmporteerd uit de zuidelijke regio's van Rusland, China, Europese landen en andere landen.
Volgens berekeningen van E. Mayr (1974) zijn genetische veranderingen in een lokale populatie veroorzaakt door mutaties zelden groter dan 10-5 per locus, terwijl in open populaties de uitwisseling als gevolg van de tegenstroom van genen minstens 10-3 - 10-4 is.
Migratie van geïnfecteerde knollen is verantwoordelijk voor het binnendringen van P. infestans in Europa en verspreidt zich naar alle delen van de wereld waar aardappelen worden verbouwd; ze veroorzaakten de meest ernstige bevolkingsveranderingen. Phytophthora op aardappelen verscheen bijna gelijktijdig met zijn verschijning in West-Europa op het grondgebied van het Russische rijk.
Aangezien de ziekte voor het eerst werd opgemerkt in 1846-1847 in de Baltische staten en zich pas in de daaropvolgende jaren verspreidde in Wit-Rusland en de noordwestelijke regio's van Rusland, is de West-Europese oorsprong duidelijk. De eerste bron van Phytophthora in de Oude Wereld is niet zo duidelijk. De hypothese die is ontwikkeld door Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) suggereert dat de parasiet eerst vanuit Mexico naar Noord-Amerika kwam, waar hij zich over gewassen verspreidde en vervolgens naar West-Europa werd vervoerd. (Afb. 7).
Als gevolg van de herhaalde drift (dubbel effect van de "bottleneck") kwamen enkele klonen naar Europa, waarvan de nakomelingen een pandemie veroorzaakten op het hele grondgebied van de Oude Wereld, waar aardappelen worden verbouwd. Als bewijs voor deze hypothese noemen de auteurs ten eerste het alomtegenwoordige voorkomen van slechts één type paring (A1) en ten tweede de homogeniteit van de genotypen van de bestudeerde stammen uit verschillende regio's (ze zijn allemaal gebaseerd op moleculaire markers, waaronder 2 isozymloci, DNA-vingerafdrukpatronen, en de structuur van mitochondriaal DNA is identiek en komt overeen met de kloon US-1 beschreven in de VS). Sommige gegevens doen echter twijfels rijzen over ten minste enkele bepalingen van de genoemde hypothese. Analyse van P. infestans mitochondriaal DNA geïsoleerd uit herbariumaardappelmonsters geïnfecteerd tijdens de eerste epifytotische periode in de jaren 40 toonde aan dat ze verschillen in de structuur van mitochondriaal DNA van kloon US-1, die daarom tenminste was niet de enige infectiebron in Europa (Ristaino et al, 2001).
De situatie van de Phytophthora verslechterde opnieuw in de jaren 80 van de twintigste eeuw. De volgende wijzigingen zijn opgetreden:
1) De gemiddelde agressiviteit van de bevolking is toegenomen, wat met name heeft geleid tot de wijdverbreide verspreiding van de meest schadelijke vorm van Phytophthora: schade aan bladstelen en stengels.
2) Er was een verschuiving in de tijd van Phytophthora bij aardappelen - van eind juli tot begin juli en zelfs tot eind juni.
3) Het A2-paringstype, dat voorheen afwezig was in de Oude Wereld, is alomtegenwoordig geworden.
De veranderingen werden voorafgegaan door twee gebeurtenissen: het massale gebruik van het nieuwe fungicide metalaxyl (Schwinn en Staub, 1980) en de opkomst van Mexico als wereldexporteur van aardappelen (Niederhauser, 1993). In overeenstemming hiermee werden twee redenen voor populatieveranderingen aangevoerd: omschakeling van het paringstype onder invloed van metalaxyl (Ko, 1994) en de massale introductie van nieuwe stammen met geïnfecteerde knollen uit Mexico (Fry en Goodwin, 1995). Hoewel onderlinge omzettingen van paringstypes onder invloed van metalaxyl niet alleen door Ko werden verkregen, maar ook in werken die werden uitgevoerd in het laboratorium van de Moscow State University (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), verdient de tweede hypothese de voorkeur. Naast het verschijnen van het tweede type paring vonden er serieuze veranderingen plaats in de genotypen van Russische P. infestans-stammen, ook in neutrale genen (isozym- en RFLP-loci), evenals in de structuur van mitochondriaal DNA. Het complex van deze veranderingen kan niet worden verklaard door de werking van metalaxyl; er was eerder een massale import van nieuwe soorten uit Mexico, die, omdat ze agressiever waren (Kato et al., 1997), de oude soorten (US-1) verdrongen en dominant werden in de populaties. De verandering in de samenstelling van Europese populaties vond plaats in zeer korte tijd - van 1980 tot 1985 (Fry et al., 1992). Op het grondgebied van de voormalige USSR werden "nieuwe stammen" gevonden in collecties uit Estland in 1985, dat wil zeggen eerder dan in Polen en Duitsland (Goodwin et al., 1994). De laatste keer dat de "oude stam US-1" in Rusland werd geïsoleerd uit een geïnfecteerde tomaat in de regio Moskou in 1993 (Dolgova et al., 1997). Ook in Frankrijk werden tot het begin van de jaren negentig "oude" soorten aangetroffen in tomatenplantages, dat wil zeggen nadat ze allang verdwenen waren op aardappelen (Leberton en Andrivon, 90). Veranderingen in P. infestans-stammen hadden invloed op veel eigenschappen, waaronder die van groot praktisch belang, en verhoogden de schadelijkheid van Phytophthora.
Seksuele recombinatie
Om seksuele recombinatie te laten bijdragen aan de variabiliteit, is het ten eerste de aanwezigheid van twee soorten paring in de populatie in een verhouding dicht bij 1: 1, en ten tweede de aanwezigheid van initiële populatievariabiliteit.
De verhouding van paringstypes varieert sterk in verschillende populaties en zelfs in verschillende jaren in één populatie (Tabel 9,10, 90). De redenen voor dergelijke drastische veranderingen in de frequentie van paringstypes in populaties (zoals bijvoorbeeld in Rusland of Israël in het begin van de jaren 2002 van de vorige eeuw) zijn onbekend, maar aangenomen wordt dat dit het gevolg is van de introductie van meer competitieve klonen (Cohen, XNUMX).
Sommige indirecte gegevens geven het verloop van het seksuele proces in bepaalde jaren en in bepaalde regio's aan:
1) Studies van populaties uit de regio Moskou toonden aan dat in 13 populaties waarin het aandeel van A2-paringstype minder dan 10% was, de totale genetische diversiteit berekend voor drie isozymloci 0,08 was, en in 14 populaties waarin het aandeel van A2 groter was dan 30%, de genetische diversiteit was twee keer zo hoog (0,15) (Elansky et al., 1999). Dus hoe groter de kans op geslachtsgemeenschap, hoe groter de genetische diversiteit van de bevolking.
2) De relatie tussen de verhouding van paringstypes in populaties en de intensiteit van de vorming van oosporen werd waargenomen in Israël (Cohen et al., 1997) en in Nederland
(Flier et al., 2004). Onze studies hebben aangetoond dat in populaties waarin isolaten met het A2-paringstype 62, 17, 9 en 6% voor hun rekening namen, oösporen werden aangetroffen in respectievelijk 78, 50, 30 en 15% van de geanalyseerde aardappelbladeren (met 2 of meer vlekken).
Monsters met 2 of meer spots bevatten veel meer oösporen dan monsters met 1 spot (respectievelijk 32 en 14% van de monsters) (Apryshko et al., 2004).
Oösporen kwamen veel vaker voor in de bladeren van de middelste en onderste laag van de aardappelplant (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) In sommige regio's zijn unieke genotypen ontdekt, waarvan het voorkomen wordt geassocieerd met seksuele recombinatie. Zo zijn in Polen in 1989 en in Frankrijk in 1990 stammen die homozygoot zijn voor de glucose-6-
fosfaatisomerase (GPI 90/90). Omdat voorheen slechts 10/90 heterozygoten werden aangetroffen gedurende 100 jaar, wordt homozygotie toegeschreven aan seksuele recombinatie (Sujkowski et al., 1994). In Colombia (VS) komen isolaten die A2 met GPI 100/110 en A1 combineren met GPI 100/100 veel voor, maar aan het einde van het seizoen 1994 (16 augustus en 9 september) zijn stammen met recombinante genotypen (A1 GPI 100/110 en A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) In sommige populaties uit Polen (Sujkowski et al., 1994) en de Noord-Kaukasus (Amatkhanova et al., 2004) komt de verdeling van vingerafdruk-DNA-loci en allozyme-eiwitloci overeen met de Hardy-Weinberg-verdeling, wat aangeeft
over het hoge aandeel van de bijdrage van seksuele recombinatie aan de variabiliteit van populaties. In andere regio's van Rusland werd geen overeenkomst gevonden met de Hardy-Weinberg-verdeling in populaties, maar de aanwezigheid van onevenwichtige koppelingen werd aangetoond, wat wijst op de overheersing van klonale reproductie (Elansky et al., 1999).
5) Genetische diversiteit (GST) tussen stammen met verschillende paringstypes (A1 en A2) was lager dan tussen verschillende populaties (Sujkowski et al., 1994), wat indirect wijst op seksuele kruisingen.
Tegelijkertijd kan de bijdrage van seksuele recombinatie aan de diversiteit van de bevolking niet erg hoog zijn. Deze bijdrage is berekend voor de bevolking van de regio Moskou (Elansky et al., 1999). Volgens de berekeningen van Lewontin (1979) wordt "recombinatie, die nieuwe varianten kan produceren van twee loci met een frequentie die het product van hun heterozygotie niet overschrijdt, alleen effectief als de waarden van heterozygotie voor beide allelen al hoog zijn."
Met de verhouding van de twee soorten paren, die typisch is voor de regio Moskou, gelijk aan 4: 1, zal de recombinatiefrequentie 0,25 zijn. De kans dat gekruiste stammen heterozygoot zullen zijn voor twee van de drie bestudeerde isozymloci in de bestudeerde populaties was 0,01 (2 van de 177 stammen). Daarom mag de kans op het optreden van dubbele heterozygoten als gevolg van recombinatie niet groter zijn dan hun product vermenigvuldigd met de kans op kruising (0,25x0,02x0,02) = 10-4, d.w.z. seksuele recombinanten vallen gewoonlijk niet in de bestudeerde steekproef van stammen. Deze berekeningen zijn gemaakt voor populaties uit de regio Moskou die wordt gekenmerkt door een relatief hoge variabiliteit. In monomorfe populaties zoals de Siberische, kan het seksuele proces, zelfs als het in individuele populaties voorkomt, hun genetische diversiteit niet beïnvloeden.
Bovendien wordt P. infestans gekenmerkt door frequente chromosoomafwijkingen in meiose, wat leidt tot aneuploïdie (Carter et al., 1999). Dergelijke schendingen verminderen de vruchtbaarheid van de hybriden.
Parasexuele recombinatie, mitotische genconversie
In experimenten met de fusie van P. infestans-stammen met mutaties van resistentie tegen verschillende groeiremmers, werd het ontstaan van misolaten gevonden die resistent waren tegen beide remmers (Shattock en Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Stammen die resistent zijn tegen twee groeiremmers ontstonden als gevolg van heterokaryotisatie van het mycelium, en in dit geval splitsten ze zich tijdens reproductie door eenkernige zoösporen (Judelson, Ge Yang, 1998), of klieven ze niet bij monozoosporous nakomelingen, omdat ze tetraploïde (aangezien de initiële isolaten diploïde zijn) kernen (K , 1979). Heterozygote diploïden scheiden zich met een zeer lage frequentie af als gevolg van haploïdisatie, chromosoomnondisjunctie en mitotische kruising (Poedinok et al., 1982). De frequentie van deze processen zou kunnen worden verhoogd met behulp van bepaalde effecten op heterozygote diploïden (bijvoorbeeld UV-straling van kiemende sporen).
Hoewel de vorming van vegetatieve hybriden met dubbele resistentie niet alleen in vitro plaatsvindt, maar ook in aardappelknollen die zijn geïnfecteerd met een mengsel van mutanten (Kulish et al., 1978), is het nogal moeilijk om de rol van parasexuele recombinatie bij het genereren van nieuwe genotypen in populaties te beoordelen. De frequentie van vorming van segreganten als gevolg van haploïdisatie, niet-disjunctie van chromosomen en mitotische kruising zonder speciale effecten is verwaarloosbaar (minder dan 10-3).
Het voorkomen van homozygote segreganten van heterozygote stammen kan gebaseerd zijn op zowel mitotische kruising als mitotische genconversie, die in P. sojae plaatsvindt met een frequentie van 3 x 10-2 tot 5 x 10-5 per locus, afhankelijk van de stam (Chamnanpunt et al. , 2001).
Hoewel de frequentie van het voorkomen van heterokaryons en heterozygote diploïden onverwacht hoog bleek te zijn (tot tientallen procenten), vindt dit proces alleen plaats wanneer mutante culturen die uit dezelfde stam zijn verkregen, worden gesplitst. Bij gebruik van verschillende stammen die uit de natuur zijn geïsoleerd, treedt heterokaryotisatie niet op (of treedt met een zeer lage frequentie op) vanwege de aanwezigheid van vegetatieve incompatibiliteit (Poedinok en Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Bijgevolg kan de rol van parasexuele recombinatie worden gereduceerd tot alleen intraclonale recombinatie in heterozygote kernen en de overgang van individuele genen naar een homozygote toestand zonder een seksueel proces. Dit proces kan van epidemiologische betekenis zijn bij stammen met recessieve of semi-dominante fungicidenresistentie-mutaties. De overgang naar een homozygote toestand als gevolg van het parasexuele proces zal de weerstand van de drager van de mutatie verhogen (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgressie van genen
Heterothallische soorten Phytophthora zijn in staat om te kruisen met de vorming van hybride oösporen (zie Vorob'eva en Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). De natuurlijke hybride van de twee Phytophthora-soorten was zo agressief dat het duizenden elzen in het VK doodde (Brasier et al., 1999). P. infestans kan voorkomen bij andere soorten van het geslacht (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, etc.) op gewone waardplanten en in de bodem, maar er is in de literatuur weinig informatie over de mogelijkheid van interspecifieke hybriden. Onder laboratoriumomstandigheden werden hybriden tussen P. infestans en P. Mirabilis verkregen (Goodwin en Fry, 1994).
Tabel 9. Het aandeel P. infestans-stammen met het A2-paringstype in verschillende landen van de wereld in de periode van 1990 tot 2000 (volgens de gegevens van open literatuurbronnen en sites www.euroblight.net, www.eucablight.org)
land | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Wit-Rusland | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
België | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estland | 8 (12) | ||||||||||
Engeland | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finland | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Frankrijk | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Hongarije | 72 (32) | ||||||||||
Ierland | 4 (145) | ||||||||||
Noorden. Ierland | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Nederland | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Noorwegen | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984-86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polen | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Schotland | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Zweden | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
China | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Colombia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Marokko | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mexico (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabel 10. Het aandeel P. infestans-stammen met het A2-paringstype in verschillende landen van de wereld in de periode van 2000 tot 2011
land | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Oostenrijk | 65 (83) | ||||||||||
Wit-Rusland | 42 (78) | ||||||||||
België | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Zwitserland | 89 (19) | ||||||||||
Tsjechische Republiek | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Duitsland | 95 (53) | ||||||||||
Denemarken | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estland | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Engeland | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finland | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Frankrijk | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Hongarije | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Noorden. Ierland | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Nederland | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Noorwegen | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Polen | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Schotland | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Zweden | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slowakije | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korea | 46 (26) | ||||||||||
Brazilië | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
China | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Oeganda | 0 (8) |
Dynamiek van de genotypische samenstelling van populaties
Veranderingen in de genotypische samenstelling van P. infestans-populaties kunnen optreden onder invloed van migratie van nieuwe klonen uit andere regio's, landbouwpraktijken (verandering van variëteiten, toepassing van fungiciden) en weersomstandigheden. Externe invloeden hebben een verschillende invloed op klonen in verschillende stadia van de levenscyclus; daarom ervaren populaties jaarlijks cyclische veranderingen in de frequenties van genen die onderhevig zijn aan selectie, als gevolg van een verandering in de dominante rol van gendrift en selectie.
Invloed van de variëteit
Nieuwe cultivars met effectieve genen voor verticale resistentie (R-genen) zijn een krachtige selectieve factor die klonen met complementaire virulentiegenen selecteert in populaties van P. infestans. Bij afwezigheid van niet-specifieke resistentie in de aardappelvariëteit die de groei van de pathogene populatie remt, verloopt het proces van vervanging van de dominante klonen in de populatie zeer snel. Dus na de verspreiding in de regio Moskou van de Domodedovsky-variëteit, die het R3-resistentiegen heeft, nam de frequentie van virulente klonen voor deze variëteit in één jaar toe van 0,2 tot 0,82 (Dyakov, Derevjagina, 2000).
De verandering in de frequenties van virulentiegenen (pathotypes) in populaties vindt echter niet alleen plaats onder invloed van gekweekte aardappelrassen. Zo domineerden in Wit-Rusland tot 1977 klonen met virulentiegenen 1 en 4, die werd veroorzaakt door de teelt van aardappelrassen met resistentiegenen R1 en R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Aan het einde van de jaren 70 van de twintigste eeuw verschenen echter klonen met verschillende virulentiegenen en hun combinaties, en de complementaire resistentiegenen werden nooit gebruikt bij de aardappelteelt (extra virulentiegenen) (Ivanyuk et al., 2002). De reden voor het verschijnen van dergelijke klonen is blijkbaar te wijten aan de migratie naar Europa van besmettelijk materiaal uit Mexico met aardappelknollen. Thuis ontwikkelden deze klonen zich niet alleen op gekweekte aardappelen, maar ook op wilde soorten met een verscheidenheid aan resistentiegenen; daarom was de combinatie van vele virulentiegenen in het genoom nodig om in die omstandigheden te overleven.
Wat betreft variëteiten met niet-specifieke resistentie, ze vertragen, door de reproductiesnelheid van de ziekteverwekker te verminderen, de evolutie van de populaties, die, zoals eerder vermeld, een functie is van het aantal. Omdat agressiviteit polygeen is, accumuleren klonen die een groter aantal genen voor "agressiviteit" bevatten, hoe eerder hoe groter de populatieomvang. Daarom zijn zeer agressieve rassen geen product van aanpassing aan gekweekte variëteiten met niet-specifieke resistentie, maar worden ze daarentegen eerder gedetecteerd in de aanplant van zeer gevoelige variëteiten die accumulatoren zijn van de parasietensporen.
Zo werden in Rusland de meest agressieve populaties van P. Infestans gevonden in de zones met jaarlijkse epifytotieën (populaties uit de regio's Sakhalin, Leningrad en Bryansk). De agressiviteit van deze populaties bleek hoger te zijn dan die van de Mexicaanse (Filippov et al., 2004).
Bovendien worden er minder oösporen gevormd in de bladeren van resistente variëteiten dan in vatbare variëteiten (Hanson en Shattock, 1998), dat wil zeggen dat de niet-specifieke resistentie van de variëteit ook het recombinatievermogen van de parasiet vermindert en de mogelijkheid van alternatieve overwinteringsmethoden.
Invloed van fungiciden
Fungiciden verminderen niet alleen het aantal fytopathogene schimmels, d.w.z. beïnvloeden de kwantitatieve kenmerken van hun populaties, maar ze kunnen ook de frequenties van individuele genotypen veranderen, d.w.z. invloed hebben op de kwalitatieve samenstelling van populaties. Een van de belangrijkste indicatoren van populaties die onder invloed van fungiciden veranderen, zijn de volgende: veranderingen in resistentie tegen fungiciden, veranderingen in agressiviteit en virulentie, en veranderingen in kweeksystemen.
Invloed van fungiciden op de resistentie en agressiviteit van populaties
De mate van deze invloed wordt allereerst bepaald door het gebruikte type fungicide, dat voorwaardelijk kan worden onderverdeeld in polysite, oligosiet en monosiet.
De eerste omvat de meeste contactfungiciden. Weerstand ertegen (als het überhaupt mogelijk is) wordt beheerst door een groot aantal zeer zwak expressieve genen. Deze eigenschappen bepalen de afwezigheid van zichtbare veranderingen in de resistentie van de populatie na behandeling met fungiciden (hoewel in sommige experimenten enige toename in resistentie werd verkregen). De schimmelpopulatie die geconserveerd is na besproeien met contactfungiciden bestaat uit twee groepen stammen:
1) Stammen die worden bewaard in plantengebieden die niet met het medicijn zijn behandeld. Omdat er geen contact was met het fungicide, verandert de agressiviteit en resistentie van deze stammen niet.
2) Stammen in contact met het fungicide, waarvan de concentratie op de contactpunten lager dan dodelijk was. Zoals hierboven vermeld, verandert de resistentie van dit deel van de bevolking ook niet, vanwege het gedeeltelijk schadelijke effect van het fungicide, zelfs in subletale concentratie op het metabolisme van de schimmelcel, de algemene fitheid en zijn parasitaire component, agressiviteit, afnemen (Derevyagina en Dyakov, 1990).
Dus zelfs een deel van de bevolking dat niet is overleden, blootgesteld aan contact met het fungicide, heeft een zwakke agressiviteit en kan geen bron van epifytica zijn. Daarom is een zorgvuldige behandeling die de frequentie van het deel van de bevolking dat niet in contact komt met het fungicide, een voorwaarde voor het succes van beschermende maatregelen. De resistentie tegen oligosiet-fungiciden wordt beheerst door verschillende additieve genen.
Mutatie van elk gen leidt tot enige toename van resistentie, en de algehele mate van resistentie is het gevolg van de toevoeging van dergelijke mutaties. Daarom vindt de toename van de weerstand stapsgewijs plaats. Een voorbeeld van een stapsgewijze toename van de resistentie zijn mutaties in resistentie tegen het fungicide dimethomorph, dat veel wordt gebruikt om aardappelen te beschermen tegen Phytophthora. Dimethomorfe resistentie is polygeen en additief. Een eenstaps-mutatie verhoogt de weerstand enigszins.
Elke volgende mutatie vermindert de grootte van het doelwit en, bijgevolg, de frequentie van volgende mutaties (Bagirova et al., 2001). De toename van de gemiddelde resistentie van de bevolking na herhaalde behandelingen met oligosiet-fungicide verloopt stapsgewijs en geleidelijk. De snelheid van dit proces wordt bepaald door tenminste drie factoren: de frequentie van mutatie van resistentiegenen, de coëfficiënt van resistentie (de verhouding van de letale dosis van een resistente stam ten opzichte van een gevoelige stam) en het effect van mutaties in resistentiegenen op fitheid.
De incidentie van elke volgende mutatie is lager dan de vorige, dus het proces heeft een dempend karakter (Bagirova et al., 2001). Als recombinatieprocessen (seksueel of parasexueel) echter voorkomen in een populatie, is het mogelijk om verschillende oudermutaties in een hybride stam te combineren en het proces te versnellen. Daarom verwerven panmix-populaties sneller resistentie dan agamische populaties, en in de laatste populaties die geen vegetatieve incompatibiliteitsbarrières hebben, sneller dan populaties die door dergelijke barrières worden gedeeld. In dit opzicht versnelt de aanwezigheid van stammen in populaties die verschillen in de soorten paring het proces van resistentie tegen oligosiet-fungiciden.
De tweede en derde factoren dragen niet bij aan de snelle accumulatie van dimethomorf-resistente stammen in populaties. Elke volgende mutatie verdubbelt ongeveer de resistentie, wat onbeduidend is, en vermindert tegelijkertijd zowel de groeisnelheid in een kunstmatige omgeving als de agressiviteit (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Misschien is dit de reden waarom er praktisch geen resistente stammen zijn onder de natuurlijke P. infestans-stammen, zelfs niet die afkomstig zijn van aardappelplantages die zijn behandeld met dimethomorf.
Een populatie die wordt behandeld met een oligosiet-fungicide zal ook uit twee groepen stammen bestaan: degenen die niet in contact zijn geweest met het fungicide en daarom de oorspronkelijke kenmerken niet hebben veranderd (als er resistente stammen in deze groep zijn, zullen ze niet accumuleren vanwege de hogere agressiviteit en competitiviteit van gevoelige stammen), en stammen die in contact komen met subletale concentraties van het fungicide. Een van de laatste is dat de accumulatie van resistente stammen mogelijk is, omdat ze hier voordelen hebben ten opzichte van gevoelige stammen.
Daarom is bij het gebruik van oligosiet-fungiciden niet zozeer een grondige behandeling belangrijk als een hoge concentratie van het medicijn, meerdere keren hoger dan de letale dosis, omdat bij stapsgewijze mutagenese de initiële resistentie van gemuteerde stammen laag is.
Ten slotte zijn mutaties in resistentie tegen monosiet-fungiciden zeer expressief, dat wil zeggen dat één mutatie een hoog niveau van resistentie kan rapporteren, tot volledig verlies van gevoeligheid. Daarom treedt de toename van de weerstand van populaties erg snel op.
Een voorbeeld van dergelijke fungiciden zijn fenylamiden, waaronder het meest voorkomende fungicide metalaxyl. Mutaties van resistentie ertegen ontstaan met een hoge frequentie, en de mate van resistentie bij mutanten is zeer hoog - het overtreft de gevoelige stam met een factor duizend of meer (Derevyagina et al., 1993). Hoewel de groeisnelheid en agressiviteit van resistente mutanten afnemen tegen de achtergrond van de dood van gevoelige stammen door een systemisch fungicide, groeit het aantal resistente populaties snel en neemt de agressiviteit parallel toe. Daarom kan de agressiviteit van resistente stammen na enkele jaren van gebruik van het fungicide niet alleen de agressiviteit van gevoelige stammen evenaren, maar deze ook overtreffen (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Impact op seksuele recombinatie
Aangezien het veelvuldig voorkomen van het A2-paringstype in P. infestans-populaties samenviel met het intensieve gebruik van metalaxyl tegen Phytophthora, werd gesuggereerd dat metalaxyl conversie van het paringstype induceert. Bij P. parasitica werd een dergelijke omzetting onder invloed van chloorb en metalaxyl experimenteel bewezen (Ko, 1994). Een enkele passage op een medium met een lage metalaxylconcentratie leidde tot het ontstaan van homothallische isolaten van een stam van P. infestans die gevoelig is voor metalaxyl met paringstype A1 (Savenkova en Cherepnikova-Anikina, 2002). Tijdens daaropvolgende passages op media met een hogere metalaxylconcentratie werd geen enkel isolaat met het A2-paringstype gedetecteerd, maar de meeste isolaten, wanneer ze werden gekruist met A2-isolaten, in plaats van oösporen, vormden lelijke myceliumophopingen en waren steriel. Doorgangen van een resistente stam met het A2-paringstype op media met een hoge concentratie metalaxyl lieten ons toe om drie vormen van paringstypeveranderingen te detecteren: 1) volledige steriliteit wanneer gekruist met A1- en A2-isolaten; 2) homotallisme (de vorming van oösporen in een monocultuur); 3) conversie van A2-paringstype naar A1. Metalaxyl kan dus veranderingen veroorzaken in de soorten paring in P. infestans-populaties en bijgevolg het optreden van seksuele recombinatie daarin.
Invloed op vegetatieve recombinatie
Sommige genen voor antibioticaresistentie verhoogden de frequentie van hyphale heterokaryotisatie en nucleaire diploïdisatie (Poedinok en Dyakov, 1981). Zoals eerder opgemerkt, komt heterokaryotisatie van hyfen tijdens fusie van verschillende stammen van P. infestans zeer zelden voor vanwege het fenomeen van vegetatieve incompatibiliteit bij deze schimmel. Genen voor resistentie tegen sommige antibiotica kunnen echter bijwerkingen hebben, uitgedrukt in het overwinnen van vegetatieve incompatibiliteit. Deze eigenschap was in het bezit van het 1S-1-mutante streptomycineresistentiegen. De aanwezigheid van dergelijke mutanten in de veldpopulaties van phytophthora kan de stroom van genen tussen stammen vergroten en de aanpassing van de hele populatie aan nieuwe variëteiten of fungiciden versnellen.
Bepaalde fungiciden en antibiotica kunnen de frequentie van mitotische recombinatie beïnvloeden, wat ook de genotype-frequenties in populaties kan veranderen. Het veel gebruikte fungicide benomyl bindt zich aan bètatubuline, een eiwit waaruit microtubuli van het cytoskelet zijn opgebouwd, en verstoort daardoor de processen van chromosoomscheiding in de anafase van mitose, waardoor de frequentie van mitotische recombinatie toeneemt (Hastie, 1970).
Het fungicide para-fluorfenylalanine, dat wordt gebruikt om de Nederlandse ziekte bij iepen te behandelen, heeft dezelfde eigenschap. Para-fluorfenylalanine verhoogde de frequentie van recombinatie in heterozygote diploïden P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Cyclische veranderingen in de genotypische samenstelling van populaties in de levenscyclus van P. infestans
De klassieke ontwikkelingscyclus van P. infestans in de gematigde zone bestaat uit 4 fasen.
1) De fase van exponentiële groei van de bevolking (polycyclische fase) met korte generaties. Deze fase begint meestal in juli en duurt 1,5-2 maanden.
2) De fase van het stoppen van de groei van de bevolking door een sterke afname van het aandeel onaangetast weefsel of het begin van ongunstige weersomstandigheden. Deze fase in bedrijven die vroeg voor de oogst bladverwijdering uitvoeren, valt buiten de jaarcyclus.
3) De fase van overwintering in knollen, vergezeld van een aanzienlijke afname van de populatiegrootte als gevolg van onbedoelde infectie van knollen, de langzame ontwikkeling van infectie daarin, de afwezigheid van herinfectie van knollen, rot en ruimen van aangetaste knollen onder normale opslagomstandigheden.
4) De fase van langzame ontwikkeling in de bodem en op zaailingen (monocyclische fase), waarin de generatieduur een maand of langer kan bedragen (eind mei - begin juli). Meestal zijn op dit moment zieke bladeren moeilijk te detecteren, zelfs met speciale waarnemingen.
Fase van exponentiële bevolkingsgroei (polycyclische fase)
Talrijke waarnemingen (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) toonden aan dat aan het begin van de epifytie laag-virulente en enigszins agressieve klonen overheersen, die vervolgens worden vervangen door meer virulente en agressieve klonen. de groeisnelheid van de agressiviteit van de populatie is hoe hoger, hoe minder resistent de variëteit van de waardplant.
Naarmate de populatie groeit, neemt de concentratie van zowel selectief belangrijke genen die in commerciële variëteiten (R1-R4) worden geïntroduceerd als selectief neutraal (R5-R11) toe. Dus in de populaties nabij Moskou in 1993 nam de gemiddelde virulentie van eind juli tot half augustus toe van 8,2 naar 9,4, en de grootste toename werd waargenomen voor het selectief neutrale virulentiegen R5 (van 31 tot 86% van de virulente klonen) (Smirnov, 1996 ).
Een afname van de groeisnelheid van een populatie gaat gepaard met een afname van de parasitaire activiteit van de populatie. Daarom is in depressieve jaren zowel het totale aantal rassen als het aandeel van zeer virulente rassen lager dan in epifytotische rassen (Borisenok, 1969). Als op het hoogtepunt van de epifytotische weersomstandigheden ongunstig veranderen voor Phytophthora en aardappelplaag, neemt ook de concentratie van zeer virulente en agressieve klonen af (Rybakova et al., 1987).
De toename van de frequenties van genen die de virulentie en agressiviteit van de populatie beïnvloeden, kan te wijten zijn aan de selectie van meer virulente en agressieve klonen in de gemengde populatie. Om de selectie aan te tonen, werd een methode ontwikkeld voor de analyse van neutrale mutaties, die met succes werd gebruikt in chemostatpopulaties van gist (Adams et al., 1985) en Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
De frequentie van mutanten die resistent zijn tegen blasticidine S in de veldpopulatie van P. infestans nam af parallel met de toename van de agressiviteit van de populatie, wat duidt op een verandering in de dominante klonen tijdens de groei van de populatie (Rybakova et al., 1987).
Overwinteringsfase in knollen
Tijdens overwintering in aardappelknollen nemen de virulentie en agressiviteit van P. infestans-stammen af, en de afname van virulentie vindt langzamer plaats dan agressiviteit (Rybakova en Dyakov, 1990). Blijkbaar zijn onder omstandigheden die bevorderlijk zijn voor de snelle groei van de populatie (r-selectie) "extra" virulentiegenen en een hoge agressiviteit nuttig, daarom gaat de ontwikkeling van epifytotica gepaard met de selectie van de meest virulente en agressieve klonen. In omstandigheden van verzadiging van de omgeving, wanneer niet de snelheid van voortplanting, maar het voortbestaan van bestaan onder ongunstige omstandigheden (K-selectie) een belangrijke rol speelt, verminderen 'extra' genen van virulentie en agressiviteit de fitheid, en klonen met deze genen sterven als eerste uit, zodat de gemiddelde agressiviteit en de virulentie van de bevolking neemt af.
Vegetatiefase in de bodem
Deze fase is de meest mysterieuze in de levenscyclus (Andrivon, 1995). Het bestaan ervan wordt puur speculatief gepostuleerd - vanwege het gebrek aan informatie over wat er met de ziekteverwekker gebeurt gedurende een lange periode (soms meer dan een maand) - vanaf de opkomst van aardappelzaailingen tot het verschijnen van de eerste plekken van de ziekte erop. Op basis van waarnemingen en experimenten werd het gedrag van de schimmel in deze levensperiode gereconstrueerd (Hirst en Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sporulatie van de schimmel kan zich vormen op geïnfecteerde knollen in de grond. De resulterende sporen ontkiemen met hyfen, die lang in de grond kunnen vegeteren. Primaire (gevormd op knollen) en secundaire (op het mycelium in de grond) sporen stijgen naar het bodemoppervlak door capillaire stromen, maar verwerven het vermogen om aardappelen te infecteren nadat de onderste bladeren zijn afgedaald en in contact komen met het bodemoppervlak. Dergelijke bladeren (namelijk de eerste plekken van de ziekte worden erop gevonden) vormen zich niet onmiddellijk, maar na langdurige groei en ontwikkeling van aardappeltoppen.
Zo kan de saprotrofe vegetatiefase ook voorkomen in de levenscyclus van P. infestans. Als in de parasitaire fase van de levenscyclus agressiviteit het belangrijkste onderdeel is van fitness, dan is selectie in de saprotrofe fase gericht op het verminderen van de parasitaire eigenschappen, zoals experimenteel is aangetoond voor sommige fytopathogene schimmels (zie Carson, 1993). Daarom zouden in deze fase van de cyclus agressieve eigenschappen het meest intensief verloren moeten gaan. Maar tot nu toe zijn er geen directe experimenten uitgevoerd om de bovenstaande aannames te bevestigen.
Seizoensveranderingen hebben niet alleen invloed op de pathogene eigenschappen van P. infestans, maar ook op de resistentie tegen fungiciden, die groeit in de polycyclische fase (tijdens epifytotieën) en afneemt tijdens winteropslag (Derevyagina et al., 1991; Kadish en Cohen, 1992). Een bijzonder sterke daling van de resistentie tegen metalaxyl werd waargenomen tussen het planten van de aangetaste knollen en het verschijnen van de eerste plekken van de ziekte in het veld.
Intraspecifieke specialisatie en de evolutie ervan
P. infestans veroorzaakt epidemieën in twee commercieel belangrijke gewassen, aardappelen en tomaat. Epifytotieën op aardappelen begonnen kort nadat de schimmel nieuwe gebieden was binnengekomen. De nederlaag van tomaat werd ook opgemerkt kort na het verschijnen van infectie op aardappelen, maar epifytieën op tomaat werden pas honderd jaar later opgemerkt - in het midden van de XNUMXe eeuw. Dit is wat Hallegli en Niederhauser schrijven over de nederlaag van tomaten in de VS.
(1962): “Ongeveer 100 jaar na de ernstige epifytie van 1845 werden er weinig of bijna geen pogingen ondernomen om resistente tomatensoorten te verkrijgen. Hoewel Phytophthora al in 1848 voor het eerst op tomaten werd aangetroffen, werd het pas het onderwerp van serieuze aandacht van veredelaars op deze plant tot een sterke uitbraak van de ziekte in 1946. Op het grondgebied van Rusland werd de aardappelziekte in de 60e eeuw geregistreerd. “Onderzoekers hebben lange tijd geen aandacht besteed aan deze ziekte, aangezien deze geen noemenswaardige economische schade aanrichtte. Maar in de jaren 70 en 1979. Epifytieën uit de twintigste eeuw van Phytophthora op tomaat worden ook waargenomen in de Sovjet-Unie, voornamelijk in de regio Beneden-Wolga, in de Oekraïne, de Noord-Kaukasus, in Moldavië ... ”(Balashova, XNUMX).
Sindsdien is de aardappelziekte door Phytophthora eenjarig geworden, heeft het zich over het hele grondgebied van de industriële en thuiskweek verspreid en veroorzaakt het enorme economische schade aan dit gewas. Wat is er gebeurd? Waarom kwamen de eerste verschijning van de parasiet op aardappelen en de epifytotische laesie van dit gewas bijna gelijktijdig voor, en waarom duurde het een eeuw voordat het epifyticum op tomaat verscheen? Deze verschillen ondersteunen een Mexicaanse in plaats van een Zuid-Amerikaanse infectiebron. Als de soort Phytophthora infestans zich vormde als een parasiet van de Mexicaanse knoldragende soort van het geslacht Solanum, dan is het begrijpelijk waarom gekweekte aardappelen die tot dezelfde sectie van het geslacht behoren als de Mexicaanse soort zo sterk werden aangetast, maar vanwege het ontbreken van co-evolutie met de parasiet, die geen mechanismen van specifieke en niet-specifieke resistentie ontwikkelde.
Tomaat behoort tot een andere sectie van het geslacht, het type uitwisseling heeft aanzienlijke verschillen met knolachtige soorten, daarom, ondanks het feit dat de tomaat niet buiten de voedselspecialisatie van P. infestans valt, was de intensiteit van de schade onvoldoende voor ernstige economische verliezen.
Het ontstaan van epifytotieën op een tomaat is te wijten aan ernstige genetische veranderingen in de parasiet, waardoor de conditie (pathogeniteit) tijdens parasitisme toenam. Wij zijn van mening dat de nieuwe vorm die gespecialiseerd is in het parasiteren van de tomaat het T1-ras is, beschreven door M. Gallegly, dat betrekking heeft op soorten cherrytomaat (Red Cherry, Ottawa), resistent tegen het T0-ras dat wijdverspreid is op aardappelen (Gallegly, 1952). Blijkbaar een mutatie (of een reeks mutaties) die het T0-ras in het T1-ras veranderde en leidde tot de opkomst van klonen die zeer geschikt waren om tomaat te verslaan. Zoals vaak gebeurt, ging een toename van de pathogeniteit naar de ene gastheer gepaard met een afname ervan naar de andere, dat wil zeggen dat er een eerste, nog niet volledige intraspecifieke specialisatie ontstond - naar aardappelen (ras T0) en naar tomaat (ras T1).
Wat is het bewijs voor deze aanname?
- Voorkomen op aardappelen en tomaten. Op tomatenbladeren domineert het T1-ras, terwijl het op aardappelbladeren zeldzaam is. Volgens S.F.Bagirova en T.A. Oreshonkova (niet gepubliceerd) in de regio Moskou in 1991-1992, het voorkomen van het T1-ras bij aardappelplantages was 0% en bij tomatenplantages - 100%; in 1993-1995 - respectievelijk 33% en 90%; in 2001 - 0% en 67%. Vergelijkbare gegevens werden verkregen in Israël (Cohen, 2002). Experimenten met de infectie van aardappelknollen met isolaten van het T1-ras en een mengsel van isolaten T0 en T1 toonden aan dat isolaten van het T1-ras slecht bewaard blijven in knollen en worden vervangen door isolaten van het T0-ras (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dynamiek van de T1-race bij het planten van tomaten. Primaire infectie van tomatenbladeren wordt uitgevoerd door isolaten van het T0-ras, die domineren bij de analyse van infectie op de eerste plekken die op de bladeren worden gevormd. Dit bevestigt het algemeen aanvaarde schema van de migratie van parasieten: de belangrijkste infectiehaard door aardappelen wordt veroorzaakt door het T0-ras, maar een klein aantal T1-klonen die in aardappelen zijn bewaard, eenmaal op de tomaat, verdringt het T0-ras en hoopt zich op tegen het einde van de epifytische periode. Het is ook mogelijk dat er een alternatieve bron van tomatenbladinfectie is met het T1-ras, dat niet zo krachtig is als aardappelknollen en -bladeren, maar constant. Daarom heeft deze bron een zwak effect op de genetische structuur van de populatie die tomaat infecteert, maar bepaalt vervolgens de accumulatie van het T1-ras (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Agressiviteit voor aardappelen en tomaten. Kunstmatige infectie van tomaten- en aardappelbladeren met isolaten van de rassen T0 en T1 toonde aan dat de eerste agressiever zijn voor aardappelen dan voor tomaat, en de laatste agressiever voor tomaat dan voor aardappel. Deze verschillen komen tot uiting in de verplaatsing van isolaten van een niet-“eigen” ras uit een gemengde populatie tijdens bladpassages in een kas (D'yakov et al., 1975) en in veldpercelen (Leberton et al., 1999); verschillen in de minimale infectieuze belasting, latentietijd, grootte van infectieuze plekken en sporenproductie (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al. al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
De agressiviteit van isolaten van het T1-ras tegen tomatenrassen zonder resistentiegenen is zo hoog dat deze isolaten sporen op bladeren als op een voedingsmedium zonder het geïnfecteerde weefsel te necrotiseren (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulentie voor aardappelen en tomaten. Het T1-ras is van invloed op cherrytomatenrassen met het Ph1-resistentiegen, terwijl het T0-ras deze rassen niet kan infecteren, d.w.z. heeft een smallere virulentie. Met betrekking tot differentiatoren
De R-genen van aardappelen zijn omgekeerd evenredig, d.w.z. stammen geïsoleerd uit tomatenbladeren zijn minder virulent dan "aardappel" -stammen (tabel 11).
5) Neutrale markeringen. De analyse van neutrale merkers in de populaties van P. infestans die parasiteren op aardappelen en tomaten, getuigt ook van de multidirectionele intraspecifieke selectie. In de Braziliaanse populaties van P. infestans behoorden tomatenbladisolaten tot de clonale lijn US-1, en die van aardappelbladeren tot de BR-1 lijn (Suassuna et al., 2004). In Florida (VS) begon kloon US-1994 sinds 90 te domineren op aardappelen (met een voorkomen van meer dan 8%), en klonen US-11 en US-17 op tomaat, en de isolaten van laatstgenoemde zijn agressiever voor tomaat dan voor aardappel (Weingartner , Tombolato, 2004). Significante verschillen in genotype-frequenties (DNA-vingerafdrukken) in aardappel- en tomatenisolaten werden vastgesteld voor 1200 P. infestans-stammen verzameld in de Verenigde Staten van 1989 tot 1995 (Deahl et al., 1995).
Met behulp van de AFLP-methode is het mogelijk om 74 stammen te scheiden die in 1996-1997 zijn verzameld uit aardappel- en tomatenbladeren. in Frankrijk en Zwitserland, in 7 groepen. De aardappel- en tomatenstammen verschilden niet duidelijk, maar de "aardappel" -stammen waren genetisch meer divers dan de "tomaten". De eerste werden gevonden in alle zeven clusters, en de laatste, alleen in vier, wat duidt op een meer gespecialiseerd genoom van de laatste (Knapova en Gisi, 2002).
6) Mechanismen van isolatie. Als de populaties van de parasiet op twee waardplantensoorten evolueren naar een vernauwende specialisatie tot hun "eigen" gastheer, dan ontstaan er verschillende pre- en postmeiotische mechanismen die genetische uitwisselingen tussen populaties verhinderen (Dyakov en Lekomtseva, 1984).
Verschillende studies hebben het effect van de bron van ouderstammen op de efficiëntie van hybridisatie onderzocht. Bij het kruisen van stammen geïsoleerd uit verschillende soorten van het geslacht Solanum in Ecuador (Oliva et al., 2002), werd gevonden dat stammen met paring type A2 uit wilde Solanaceae (klonale lijn EC-2) het slechtst gekruist worden met stammen van tomaat (lijn EC -3), en het meest effectief gekruist met de aardappelstam (EC-1).
Alle hybriden bleken niet-pathogeen te zijn. De auteurs zijn van mening dat het lage percentage hybridisatie en de vermindering van pathogeniteit bij hybriden het gevolg zijn van postmeiotische mechanismen van reproductieve isolatie van populaties.
In de experimenten van Bagirova et al. (1998) werd een groot aantal aardappel- en tomatenstammen gekruist met de eigenschappen van de T0- en T1-rassen. De meest vruchtbare kruisingen van T1xT1-stammen geïsoleerd uit tomaat (36 oösporen in het gezichtsveld van de microscoop, 44% van de ontkieming van de oosporen), de minst effectieve waren kruisingen van T0xT1-rassen geïsoleerd uit verschillende gastheren (een laag aantal zich ontwikkelende en ontkiemde oösporen, een hoog aandeel abortieve en onderontwikkelde oösporen) ... De efficiëntie van kruisingen tussen isolaten van het T0-ras geïsoleerd uit aardappelen was gemiddeld. Omdat het grootste deel van de stammen van het T0-ras aardappelen aantast, heeft het een betrouwbare bron van overwintering - aardappelknollen, waardoor het belang van oösporen als overwinterende infectieuze eenheden voor populaties van aardappelen laag is. De aangepaste “tomatenvorm” kan overwinteren op de tomaat in de vorm van oösporen (zie hieronder) en behoudt daardoor een hogere productiviteit van het seksuele proces. Door zijn hoge vruchtbaarheid verkrijgt T1 een onafhankelijk potentieel voor primaire infectie bij tomaat. De resultaten van Knapova et al. (Knapova et al., 2002) kunnen op dezelfde manier worden geïnterpreteerd. Kruisen van stammen geïsoleerd uit aardappelen met stammen van tomaat gaven het hoogste aantal oösporen - 13,8 per vierkante mm. medium (met een spreiding van 5-19) en een gemiddeld percentage ontkieming van oösporen (6,3 met een spreiding van 0-24). Kruisingen van stammen geïsoleerd uit tomaat gaven het laagste percentage oösporen (7,6 met een spreiding van 4-12) met het hoogste percentage van hun ontkieming (10,8). De kruisingen tussen de stammen geïsoleerd uit aardappelen gaven een tussenliggend aantal oösporen (8,6 met een hoge spreiding van gegevens - 0-30) en het laagste ontkiemingspercentage van oösporen (2,7). Aardappelsoorten zijn dus minder vruchtbaar dan die van tomaten, maar kruisingen tussen verschillende populaties gaven geen slechtere resultaten dan intrapopulatie. Het is mogelijk dat de verschillen met de bovenstaande gegevens van Bagirova et al. worden verklaard door het feit dat Russische onderzoekers werkten met stammen die in de vroege jaren 90 van de twintigste eeuw werden geïsoleerd, en Zwitserse onderzoekers - met stammen die eind jaren 90 werden geïsoleerd.
De basis voor lage vruchtbaarheid kan de heteroploïdie van de stammen zijn. Als in Mexicaanse populaties, waar het seksuele proces en de primaire infectie met oospore-nageslacht regelmatig zijn, de meeste bestudeerde stammen van P. infestans diploïde zijn, dan wordt in de landen van de Oude Wereld intrapopulatiepolymorfisme van ploïdie waargenomen (di-, tri- en tetraploïde stammen, evenals heterokaryote stammen met heteroploïde kernen) , en stammen met verschillende soorten paring, d.w.z. onderling vruchtbaar, verschillen in nucleaire ploïdie (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Diversiteit van kernen in antheridia en oögonia kan de reden zijn voor lage vruchtbaarheid.
Wat nucleaire uitwisselingen tussen hyfen tijdens anastomosen betreft, dit wordt voorkomen door vegetatieve incompatibiliteit, die aseksuele populaties opsplitst in vele genetisch geïsoleerde klonen (Poedinok en Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Convergentie van populaties. De bovenstaande gegevens geven aan dat hybridisatie tussen "aardappel" en "tomaat" P. infestans-stammen mogelijk is. Wederzijdse herinfectie van verschillende gastheren is ook mogelijk, zij het met verminderde agressiviteit.
Een studie van populatiemerkers in isolaten uit aangrenzende aardappel- en tomatenvelden in 1993 toonde aan dat ongeveer een kwart van de isolaten die uit tomatenbladeren werden geïsoleerd, werden overgebracht van een naburig aardappelveld (Dolgova et al., 1997). Theoretisch zou kunnen worden aangenomen dat de divergentie van populaties op twee gastheren zou toenemen en zou leiden tot de opkomst van gespecialiseerde intraspecifieke vormen (f.sp. aardappel en f.sp. tomaat), vooral omdat oösporen kunnen blijven bestaan in plantenresten (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) en tomatenzaden (Rubin et al., 2001). Bijgevolg hebben tomaten momenteel een bron van regeneratie in de lente onafhankelijk van aardappelknollen.
Alles gebeurde echter anders. Door te overwinteren met oösporen kon de parasiet de smalste fase van zijn levenscyclus vermijden - de monocyclische fase van de vegetatie in de bodem, waarin de parasitaire eigenschappen afnemen, die in de zomer geleidelijk worden hersteld in de polycyclische fase.
Tabel 11. Frequenties van virulentiegenen voor aardappeldifferentiatorvariëteiten in P. infestans-stammen
land | Jaar | Gemiddeld aantal virulentiegenen in stammen | Auteur | |
van aardappelen | van tomaat | |||
Frankrijk | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Frankrijk, Zwitserland | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
Verenigde Staten van Amerika | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995 |
VS, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998 |
Israël | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusland, Mosk. regio | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rusland, verschillende regio's | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya en anderen. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Primaire zoösporen en zoösporen, die oösporen ontkiemen, hebben een hoge mate van parasitaire activiteit, vooral als oösporen parthenogenetisch gevormd zijn onder invloed van feromonen van een stam met het tegenovergestelde type paring. Daarom is het besmettelijke materiaal op tomatenzaailingen die zijn gekweekt uit zaden die zijn geïnfecteerd met oösporen, zeer pathogeen voor zowel tomaat als aardappel.
Deze veranderingen leidden tot een nieuwe herstructurering van de bevolking, uitgedrukt in de volgende belangrijke veranderingen vanuit epidemiologisch oogpunt:
- Geïnfecteerde tomatenzaailingen zijn een belangrijke bron van primaire infectie van aardappelen geworden (Filippov, Ivanyuk, persoonlijke berichten).
- Epifytotieën op aardappelen begonnen al in juni te worden waargenomen, ongeveer een maand eerder dan normaal.
- Bij het aanplanten van aardappelen nam het percentage van het T1-ras toe, wat daar eerder in een onbeduidende hoeveelheid werd aangetroffen (Ulanova et al., 2003).
- Stammen geïsoleerd uit tomatenbladeren verschilden niet langer van aardappelstammen in virulentie op aardappeldifferentiatoren van virulentiegenen en begonnen de agressiviteit van 'aardappel'-stammen te overtreffen, niet alleen op tomaat, maar ook op aardappelen (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Dus in plaats van divergentie was er een convergentie van populaties, de opkomst van een enkele populatie op twee waardplanten met een hoge virulentie en agressiviteit voor beide soorten.
Conclusie
Dus ondanks meer dan 150 jaar intensieve studie van P. infestans, in de biologie, inclusief de populatiebiologie van deze veroorzaker van de belangrijkste ziekten van gecultiveerde solanaceous planten, is er nog veel onbekend. Het is niet duidelijk hoe het doorlopen van individuele stadia van de levenscyclus de structuur van populaties beïnvloedt, wat zijn de genetische mechanismen van de gekanaliseerde variabiliteit van agressiviteit en virulentie, wat is de verhouding tussen de reproductieve en klonale reproductiesystemen in natuurlijke populaties, hoe vegetatieve incompatibiliteit wordt geërfd, wat is de rol van aardappelen en tomaten bij de primaire infectie van deze gewassen en in wat is hun effect op de structuur van parasietenpopulaties. Tot dusver zijn belangrijke praktische problemen zoals de genetische mechanismen voor het veranderen van de agressiviteit van de parasiet of de erosie van niet-specifieke aardappelresistentie nog niet opgelost. Met de verdieping en uitbreiding van het onderzoek naar aardappelziekte, stelt de parasiet nieuwe uitdagingen voor onderzoekers. De verbetering van experimentele capaciteiten, de opkomst van nieuwe methodologische benaderingen voor manipulatie met genen en eiwitten laten ons echter hopen op een succesvolle oplossing van de gestelde vragen.
Het artikel is gepubliceerd in het tijdschrift "Potato Protection" (nr. 3, 2017)