D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
De fytopathogene schimmel Colletotrichum coccodes veroorzaakt gevaarlijke ziekten bij aardappelen en tomaten, bekend als anthracnose en knolzwarte vlek. Door morfologische kenmerken zijn ze vaak moeilijk te onderscheiden van ziekten die door andere micro-organismen worden veroorzaakt; op groene tomatenvruchten kan de ziekte asymptomatisch zijn en zich alleen manifesteren op rijp rood fruit. Voor een snelle en nauwkeurige diagnose van de ziekteverwekker wordt een real-time PCR-testsysteem aangeboden. Om een testsysteem te ontwikkelen, werd de nucleotidesequentie van het glyceroltrifosfaatdehydrogenasegen van 45 C. coccodes-stammen geïsoleerd uit aardappelknollen in verschillende regio's van Rusland bepaald.
Op basis van de verkregen resultaten en analyse van vergelijkbare sequenties van andere soorten die beschikbaar zijn in de GenBank-database, werden de soortspecifieke primers en probe voor C. coccodes ontworpen. Om de specificiteit van het gecreëerde testsysteem te controleren, werd PCR uitgevoerd met DNA geïsoleerd uit zuivere culturen van 15 verschillende soorten parasitaire en saprotrofe schimmels geassocieerd met tomaten- en aardappelplanten (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). De aanwezigheid van Colletotrichum coccodes-DNA werd bepaald bij een drempelcyclus van 20-27, terwijl andere soorten werden gedetecteerd na 40 cycli of niet werden gedetecteerd. Het testsysteem maakt het mogelijk om op betrouwbare wijze C. coccodes DNA-concentraties te detecteren van meer dan 0.01 ng / mm3 in het geanalyseerde PCR-mengsel. Met het ontwikkelde testsysteem werd de aanwezigheid van C. coccodes in tomatenbladeren met schimmelziektesymptomen en in aardappelknollen zonder externe ziekteverschijnselen onderzocht. Bladeren met symptomen van schimmelinfectie werden verzameld uit twee verschillende velden in het Krasnodar-gebied, knollen - uit velden in de regio's Kostroma, Moskou, Kaluga, Nizhny Novgorod. Een tomatenblad met C. coccodes-DNA werd gevonden in het Krasnodar-gebied; een significante aanwezigheid van DNA van deze ziekteverwekker werd gedetecteerd in 5 monsters van knollen die werden gekweekt in de regio's Kostroma, Moskou, Kaluga.
Introductie
Schimmels van het geslacht Colletotrichum zijn gevaarlijke fytopathogenen die granen, groenten, kruiden, overblijvende vruchten en bessenplanten aantasten. Een van de alomtegenwoordige soorten van dit geslacht, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, is de veroorzaker van anthracnose en zwarte vlek van aardappelen en tomaten, en veroorzaakt ziekten van een aantal andere planten van de Solanaceae-familie, incl. onkruid (Dillard, 1992). C. coccodes infecteert alle ondergrondse delen van de plant, stambases, bladeren en vruchten (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Op de schil van geïnfecteerde aardappelknollen wordt de ontwikkeling van grijze vlekken met onduidelijk uitgesproken randen waargenomen, waarop zwarte stippen van sporulatie en microsclerotia duidelijk zichtbaar zijn. Tijdens opslag kunnen zweren met verzachte inhoud ontstaan in de pulp van knollen, d.w.z. de ziekte komt in de anthracnose-fase, die echter uiterst zeldzaam is.
Tegelijkertijd zijn de symptomen van anthracnose (huidzweren met kleine zwarte stippen) typisch voor tomatenvruchten. Op bladeren verschijnen de symptomen van C. coccodes als donkerbruine vlekken, meestal omzoomd door geel weefsel (Johnson, 1994).
De ontwikkeling van zwarte vlek op de knollen bederft hun uiterlijk, wat vooral opvalt bij de verkoop van gewassen roodgeschilde aardappelen. Afschilfering van de schil leidt tot overmatige verdamping en grotere opslagverliezen (Hunger, McIntyre, 1979). Schade aan andere plantorganen leidt tot opbrengstverliezen, wat werd opgemerkt in zowel open als gesloten grond (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Ziekten veroorzaakt door C. coccodes komen veel voor in bijna alle aardappelproducerende regio's van de wereld, inclusief Rusland (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). De bestrijding van deze ziekten is moeilijk vanwege de onvoldoende effectiviteit van bestaande fungiciden tegen C. coccodes en het ontbreken van resistente rassen (Read, Hide, 1995).
Het C. coccodes-inoculum kan blijven bestaan in zaadknollen (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), tomatenzaden (Ben-Daniel et al., 2010), overleven lang in de bodem, op plantenresten (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) en in onkruid (Raid, Pennypacker, 1987). De werken van een aantal auteurs (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) hebben aangetoond dat de ontwikkeling van de ziekte bij aardappelen en tomaten grotendeels afhangt van de aanwezigheid van inoculum in zaad en bodem. Om verliezen door de ziekte tot een minimum te beperken, is het daarom noodzakelijk om een diagnose te stellen (inclusief kwantitatief) van de propagules van de schimmel in het pootgoed, in de grond, in de pootaardappelknollen en tomatenzaden die voor opslag zijn gelegd. Morfologische diagnostiek in bodem en plantmateriaal kan alleen worden uitgevoerd door de aanwezigheid van microsclerotia, die echter ook in andere soorten schimmels voorkomen.
De symptomen op de knollen lijken sterk op de zilverachtige korst veroorzaakt door de schimmel Helminthosporium solani. Isolatie van Colletotrichum coccodes en Helminthosporium solani tot een zuivere cultuur is nogal moeilijk en duurt lang vanwege de langzame groei op een voedingsbodem. Om Colletotrichum-coccodes snel te identificeren, is het nodig om instrumentele diagnostische methoden te gebruiken. De handigste methode is de polymerasekettingreactie (PCR) en de modificatie ervan - real-time PCR. Momenteel wordt in Europa en de Verenigde Staten een testsysteem gebruikt dat is ontwikkeld door Britse onderzoekers (Cullen et al., 2002) voor de ITS1-regio van rDNA. Het gebruik ervan heeft goede resultaten opgeleverd bij de analyse van Russische isolaten (Belov et al, 2018). C. coccodes is echter zeer variabel en de detectie ervan uit een enkele DNA-sequentie kan tot vals-negatieve resultaten leiden. Voor een meer betrouwbare diagnose is analyse vereist voor verschillende soortspecifieke DNA-sequenties, in verband waarmee we een origineel testsysteem hebben ontwikkeld waarmee C. coccodes kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van de sequentie van het glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase-gen.
materialen en methodes
Om de effectiviteit en specificiteit van de gemaakte testsystemen te beoordelen, gebruikten we pure culturen van 15 soorten schimmels die door de auteurs werden geïsoleerd uit zieke monsters van tomatenbladeren en fruit, aardappelknollen (tabel 1). Voor isolatie werden de organen van planten met symptomen van schimmelinfectie genomen, niet meer dan één orgaan per struik.
Een schijfje van een knol met een schil, een schijfje van een tomatenvrucht en een aangetast blad werden onder een binoculaire microscoop geplaatst, waarna mycelium, sporen of een stukje weefsel werden overgebracht naar een agarmedium (wortagar) in een petrischaal met een scherp gemaakte dissectie-naald. De isolaten werden bewaard op agar schuin in reageerbuizen bij 4 ° C.
Monsters van tomatenbladeren met symptomen van schimmelziekten, bedoeld voor analyse, werden onmiddellijk na verzameling (in het veld) in 70% ethylalcohol geplaatst waarin ze werden bewaard tot DNA-isolatie. Aardappelknollen werden aan het laboratorium geleverd, ervan geschild (2 × 1 cm stuk) en ingevroren bij –20 ° С. Bevroren bewaard tot DNA-isolatie.
Zuivere schimmelkweken voor DNA-isolatie werden gekweekt in vloeibaar erwtenmedium. Het mycelium van de schimmel werd verwijderd uit het vloeibare medium, gedroogd op filtreerpapier, ingevroren in vloeibare stikstof, gehomogeniseerd, geïncubeerd in CTAB-buffer, gezuiverd met chloroform, geprecipiteerd met een mengsel van isopropanol en 0.5 M kaliumacetaat, tweemaal gewassen met 2% alcohol. Het resulterende DNA werd opgelost in gedeïoniseerd water en bewaard bij -70 ° С (Kutuzova et al., 20). De DNA-concentratie werd gemeten met behulp van een HS DNA-kwantificeringskit voor dubbelstrengs DNA op Qubit 2017 (Qiagen, Duitsland). De alcoholhoudende en ingevroren monsters werden getritureerd in vloeibare stikstof, waarna DNA-extractie werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven (voor het mycelium van zuivere schimmelculturen).
Tabel 1. Herkomst van de gebruikte schimmelsoorten
Paddestoel naam | Plant, orgel | Plaats van selectie |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | aardappelknol | Regio Kostroma, aardappelknollen van de 1e veldgeneratie, cultivar Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | aardappelblad | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | aardappelknol | Magadan-regio, pos. Tent, aardappelknol |
Cladosporium fulvum | tomatenblad | Regio Moskou, tomaat met grote vruchten |
Alternaria Tomatophila | tomaat fruit | ingediend door het personeel van het laboratorium voor mycologie en fytopathologie van het All-Russian Research Institute of Plant Protection |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tomaat fruit | Krasnodar-gebied, Krymsky-district, klasse Cream |
Fusarium oxysporum | tarwe wortel | Regio Moskou |
PCR werd uitgevoerd op een DTprime-versterker (DNA-technologie). Voor PCR werden originele primers en een probe voor het soortspecifieke gebied van het glyceroltrifosfaatdehydrogenase-gen gebruikt: forward primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, reverse primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. De primers versterken een gebied van 213 bp.
De reactie kostte 50 ng totaal DNA (bij de analyse van bladeren en knollen) en 10 ng (bij de analyse van DNA van zuivere culturen van schimmels). Het reactiemengsel (35 μl) werd door een paraffinelaag in twee delen gescheiden: de onderste (20 μl) bevatte 2 μl 10 × reactiebuffer (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM van elk deoxynucleotidetrifosfaat, 7 pmol van elke primer en 4 pmol van een hydrolyseerbare fluorescerende sonde; de bovenste bevatte 1 μl 10 × PCR-buffer en 1 U Taq-polymerase.
Door het mengsel te scheiden met paraffine kunnen de buisjes lange tijd worden bewaard bij een temperatuur van 5 ° C en kunnen ze een warme start bieden voor PCR na 10 minuten verhitten bij een temperatuur boven 80 ° C. PCR werd uitgevoerd volgens het volgende programma: 94.0 ° C - 90 s (1 cyclus); 94.0 ° C - 30 seconden; 64.0 ° C - 15 s (5 cycli); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cycli); 10.0 ° C - opslag.
resultaten en discussie
De sequenties van het glyceroltrifosfaatdehydrogenase-gen werden bepaald in 45 stammen geïsoleerd uit bladeren, stengels, aardappelknollen en tomatenfruit (Kutuzova, 2018) in verschillende regio's van Rusland. De bestudeerde sequenties van alle stammen werden verdeeld in 2 groepen die verschillen in twee nucleotiden. De nucleotidesequenties van vertegenwoordigers van beide groepen onder de nummers KY496634 en KY496635 zijn gedeponeerd in GenBank.
De primers coc70gdf, coc280gdr en de cocgdz-sonde die op hun basis zijn ontworpen, werden gecontroleerd met behulp van het BLAST-programma (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) op alle sequenties van het glyceroltrifosfaatdehydrogenase-gen van soorten van het geslacht Colletotrichum en andere organismen die beschikbaar zijn in de GenBank-database.
Er werden geen DNA-regio's gevonden van andere organismen die in hoge mate homoloog zijn aan primers en probe.
De gevoeligheid van het testsysteem werd gecontroleerd met behulp van monsters met verschillende concentraties C. coccodes DNA, DNA van een aardappelblad geïnfecteerd met anthracnose (verzameld in 2017 in Mari El, variëteit Red Scarlett), en schil van knollen aangetast door zwarte vlek (verzameld in de regio Kostroma, variëteit Red Scarlett, tabel 2). Om de aanwezigheid van DNA in knollen en aardappelbladeren te bevestigen, werden C. coccodes-stammen daaruit geïsoleerd in zuivere culturen.
De resultaten van de gevoeligheidsanalyse van het testsysteem laten zien dat het kan worden gebruikt om de aanwezigheid van C. coccodes-DNA in een monster met succes te diagnosticeren wanneer het totale gehalte in het PCR-mengsel meer dan 0.05 ng is. Dit is voldoende voor detectie, aangezien één sclerotia gemiddeld 0.131 ng bevat en één spore ongeveer 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Het testsysteem ontwikkeld door de Engelse groep (Cullen et al., 2002) vertoonde een vergelijkbare gevoeligheid (drempelcyclus 34 bij 0.05 ng DNA en 37 bij 0.005 ng).
Analyse van natuurlijke monsters die in alle gevallen C. coccodes bevatten, maakte het mogelijk om op betrouwbare wijze de aanwezigheid ervan in het monster te onthullen (tabel 2). De voorgestelde methode voor DNA-isolatie was ook toepasbaar op de analyse van natuurlijke plantenmonsters.
Tabel 2. Bepaling van de gevoeligheid van het voorgestelde testsysteem voor de identificatie van Colletotrichum coccodes voor real-time PCR
monster | DNA-hoeveelheid in monster *, ng | Drempelcyclus | C. coccodes detectie |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Knolschil 1 | 50 | 32 | + |
Knolschil 2 | 50 | 30 | + |
Knolschil 3 | 50 | 31.5 | + |
Aardappelblad | 50 | 29.5 | + |
Notitie. * In een mengsel van PCR-producten.
De specificiteit van het testsysteem werd getest op DNA-monsters die waren geëxtraheerd uit 15 soorten schimmels. Alle schimmelsoorten werden door de auteurs geïsoleerd uit aangetast en gezond fruit en bladeren van tomaat, aardappelknollen; één stam werd geïsoleerd uit tarwewortel (tabel 1). Onder de soorten die van het oppervlak van de vrucht zijn geïsoleerd, zijn er ook soorten die niet pathogeen zijn voor tomaat (bijvoorbeeld Phellinus ferrugineovelutinus).
Studies hebben aangetoond dat C. coccodes DNA werd gedetecteerd bij een drempelcyclus van 20-27, terwijl andere schimmelsoorten niet werden gedetecteerd of een signaal gaven na cyclus 40, wat kan worden toegeschreven aan een niet-specifiek ruiseffect (tabel 3).
Tabel 3. Controle van het testsysteem voor verschillende soorten paddenstoelen
Paddestoel naam | Drempelcyclus |
Colletotrichum-coccoden 1 | 20.9 |
C. kokscodes 2 | 22.6 |
C. kokscodes 3 | 23 |
C. kokscodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis faseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. Tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Notitie. * De hoeveelheid DNA in alle monsters was 10 ng.
Het ontwikkelde testsysteem werd gebruikt om C. coccodes te identificeren in tomatenbladmonsters met symptomen van necrotrofe pathogenen en pootaardappelknollen zonder zichtbare symptomen. Voor het onderzoek hebben we zaadknollen van verschillende variëteiten genomen die in de regio's Kostroma, Moskou, Kaluga en Nizhny Novgorod werden geteeld. De aanwezigheid van C. coccodes DNA werd als significant beschouwd in de monsters, bij de analyse waarvan de drempelcyclus niet hoger was dan 35. Deze drempelwaarde werd geselecteerd op basis van de betrouwbare bepaling van 0.05 ng C. coccodes DNA (drempelcyclus 33.5, Tabel 2) en het feit dat drempelcycli boven de 40, niet-specifiek DNA van een andere soorten schimmels werd gediagnosticeerd. Met deze benadering werd de significante aanwezigheid van C. coccodes-DNA gedetecteerd in 5 monsters van knollen die werden gekweekt in de Kostroma, Moskou, Kaluga-regio's en in één tomatenblad uit het Yeisk-district van de regio Krasnodar (tabellen 4, 5).
Tabel 4. Detectie van Colletotrichum coccodes op aardappelknollen *
Voorbeeld nummer | Verscheidenheid aan aardappelen | Plaats van groei | C. coccodes detectie | Drempelcyclus |
---|---|---|---|---|
1 | Red Scarlet | Kostroma regio | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Regio Moskou | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky vroeg | Regio Moskou | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga-regio | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantasie | Kaluga-regio | - | |
15 | gala | regio Nizhny Novgorod. | - | |
16 | - |
Notitie. * De hoeveelheid DNA in alle monsters was 50 ng.
Tabel 5. Detectie van Colletotrichum coccodes op tomatenbladeren *
Voorbeeld nummer | Plaats van groei | C. coccodes detectie | Drempelcyclus |
---|---|---|---|
1 | Krasnodar-gebied, Krim-district | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodar-gebied, district Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* De hoeveelheid DNA in alle monsters was 50 ng.
Het door ons ontwikkelde testsysteem doet qua gevoeligheid en specificiteit niet onder voor dat ontwikkeld door Britse onderzoekers (Cullen et al., 2002) en is geschikt voor de analyse van plantmonsters. De toepassing ervan voor de analyse van zaadknollen maakte het mogelijk om C. coccodes DNA in knollen te identificeren zonder uiterlijke tekenen van beschadiging en om de infectie van bladeren met succes te analyseren.
Tot op heden is in Rusland geen analyse van aardappelknollen op de besmetting met C. coccodes uitgevoerd. Onze eerste studie toonde aan dat van de 16 geteste zaadknollen die in verschillende regio's van de Russische Federatie worden gekweekt, er 5 C. coccodes bevatten. Dit toont aan dat zwarte vlek van aardappelknollen een veel voorkomende aardappelziekte is in Rusland en dat de rol ervan bij het verminderen van het volume en de kwaliteit van het aardappelgewas wordt onderschat.
Analyse van tomatenbladeren onthulde een significante aanwezigheid van C. coccodes-DNA in één blad van het Yeisk-district van Krasnodar Territory. Eerder werden bij het onderzoeken van tomatenvelden in Zuid-Rusland met behulp van het Britse testsysteem (Cullen et al., 2002) bladeren gevonden die C. coccodes bevatten, en in sommige velden werd een groot deel van de bladeren geïnfecteerd met C. coccodes (Belov et al., 2018). In de gebieden Krasnodar en Primorsky, de regio Moskou, vonden we tomatenvruchten, waaruit we zuivere culturen van C. coccodes konden isoleren. Het is mogelijk dat C. coccodes in Rusland veel meer op tomaat voorkomt dan nu wordt aangenomen, en ook de schadelijkheid ervan wordt onderschat.
Zo is er tot op heden voldoende informatie verzameld over de wijdverbreide verspreiding van C. coccodes op aardappelen en tomaten.
Om de rol van deze schimmel bij de ontwikkeling van aardappel- en tomatenziekten beter te begrijpen, is het noodzakelijk om de prevalentie ervan in Rusland te volgen, de rol van bodem- en zaadinfecties en de rol van zwarte vlek bij verliezen tijdens opslag te bestuderen. Het gebruik van PCR-diagnostiek kan dit werk aanzienlijk vergemakkelijken, en het gelijktijdig gebruik van beide testsystemen zal de nauwkeurigheid van de analyse aanzienlijk vergroten.
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Russian Science Foundation nr. 18-76-00009.
Het artikel is gepubliceerd in het tijdschrift "Mycology and Phytopathology" (jaargang 54, nr. 1, 2020).