ETEN. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Onlangs is aangetoond dat de ascomycete-schimmel Ilyonectria crassa aardappelknollen kan infecteren. Dit werk is het eerste dat de biologische kenmerken en resistentie tegen sommige fungiciden van de stam I. crassa geïsoleerd uit aardappelen analyseert. De sequenties van soortspecifieke regio's van de "aardappel" -stam vielen samen met die welke eerder werden verkregen voor schimmels geïsoleerd uit de wortels van narcis, ginseng, esp en beuk, leliebollen en tulpenbladeren. Blijkbaar kunnen veel wilde en tuinplanten reserves zijn van I. crassa. De onderzochte stam infecteerde tomaten- en aardappelschijfjes, maar niet de hele tomatenfruit en de intacte aardappelknol. Dit toont aan dat I. crassa een wondparasiet is. Evaluatie van resistentie tegen fludioxonil, difenoconazol en azoxystrobine op een voedingsmedium toonde een hoge werkzaamheid van deze geneesmiddelen aan.
De EC50-index (de concentratie van het fungicide, die 2 keer de radiale groei van de kolonie vertraagt ten opzichte van de fungicide controle) was gelijk aan 0.4; 7.4 en 4 mg / l, respectievelijk. Bij de fytopathologische beoordeling van aardappelknollen en de ontwikkeling van gewasbeschermingsmaatregelen moet rekening worden gehouden met de mogelijkheid van de ontwikkeling van de door I. crassa veroorzaakte ziekte.
De ontwikkeling van fytopathogene micro-organismen leidt tot grote verliezen in alle stadia van de teelt en opslag van aardappelen. Bij het plannen van beschermende maatregelen wordt in de regel rekening gehouden met bekende ziekteverwekkers, zoals soorten van de geslachten Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, enz. De laatste jaren verschijnen er echter steeds meer berichten over het verschijnen van nieuwe fytopathogene micro-organismen op aardappelen. Hun biologie is slecht bestudeerd, de effectiviteit van fungiciden die op aardappelen worden gebruikt in relatie tot hen is onbekend, diagnostische methoden zijn niet ontwikkeld. Met een enorme ontwikkeling kunnen ze aanzienlijke schade aanrichten aan het aardappelgewas. Een van deze micro-organismen is de ascomycete-schimmel Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, voor het eerst ontdekt door de auteurs op aardappelknollen (Chudinova et al., 2019).
Dit werk presenteert de resultaten van de analyse van I. crassa-stam geïsoleerd uit aardappelknollen. De morfologie van kolonies en myceliumstructuren van I. crassa, nucleotidesequenties van soortspecifieke DNA-gebieden, virulentie voor aardappelen en tomaten, en resistentie tegen enkele populaire fungiciden werden bestudeerd.
materialen en methodes
We gebruikten de I. crassa 18KSuPT2-stam die in 2018 werd geïsoleerd uit de geïnfecteerde aardappelknol die in de Kostroma-regio werd gekweekt. De knol werd aangetast door een droogrot-type met een holte bedekt met lichtbruin mycelium. Met behulp van een steriele ontleednaald werd het schimmelmycelium overgebracht naar een petrischaal met agarmedium (bierwort 10%, agar 1.5%, penicilline 1000 U / ml). De platen werden in het donker bij 24 ° C geïncubeerd.
Een Leica DM2500 lichtmicroscoop met een ICC50 HD digitale camera en een Leica M80 binoculaire microscoop met een IC80HD digitale camera (Leica Microsystems, Duitsland) werden gebruikt om de grootte en morfologie van sporen en sporenorganen te fotograferen en te evalueren.
Om DNA te isoleren, werd het schimmelmycelium gekweekt in vloeibaar erwtenmedium, vervolgens ingevroren in vloeibare stikstof, gehomogeniseerd, geïncubeerd in CTAB-buffer, gezuiverd met chloroform en tweemaal gewassen met 2% alcohol.
De DNA-extractiemethode wordt in detail beschreven in het artikel van Kutuzova et al. (2017).
Om de soort met moleculaire methoden te bepalen en te vergelijken met andere bekende I. crassa-stammen, werd PCR uitgevoerd met primers die amplificatie van soortspecifieke DNA-regio's mogelijk maakten: ITS1-5,8S-ITS2 (primers ITS5 / ITS4, White et al., 1990), genregio's b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) en translatie-verlengingsfactor la (tef1a) (primers EF1-1F / EF728-1R, Carbone en Kohn, 986). Amplicons van de gewenste lengte werden uit de gel gehaald met behulp van de Evrogen CleanUp-kit. De geamplificeerde regio's werden gesequenced met behulp van de BigDye® Terminator v1999 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, VS) op een Applied Biosystems 3.1 xl geautomatiseerde sequencer (Applied Biosystems, CA, VS). De resulterende nucleotidesequenties werden gebruikt om te zoeken naar een overeenkomst in de GenBank-database van het Amerikaanse National Center for Biotechnology Information (NCBI). Fylogenetische analyse werd uitgevoerd met behulp van het MEGA 3730-programma (Tamura et al., 6).
De virulentiebepaling werd uitgevoerd op hele groene vruchten van grootvruchtige tomaat (variëteit Dubrava) en aardappelknollen (variëteit Gala). Om schade aan beschadigd fruit en knollen te simuleren, hebben we bovendien plakjes van hetzelfde fruit en dezelfde knollen gebruikt. Plakjes knollen werden in vochtige kamers geplaatst, dit waren petrischalen met onderaan nat filterpapier. Er werd een objectglaasje op het papier gelegd, waarop op hun beurt plakjes knollen of fruit werden geplaatst. Hele knollen en vruchten werden ook in containers met nat filtreerpapier aan de onderkant geplaatst. In het midden van de plak (of op het intacte oppervlak van de knol of vrucht) werd een stuk agar (5 x 5 mm) met schimmeldraden geplaatst na 5 dagen groeien op wortagar.
Evaluatie van de resistentie van schimmelstammen tegen fungiciden werd uitgevoerd onder laboratoriumomstandigheden op agar-voedingsmedium. We hebben de gevoeligheid voor fungiciden Maxim, KS (actieve ingrediënt fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazol 250 g / l) (Staatscatalogus ..., 2020) onderzocht. De evaluatie werd uitgevoerd in petrischalen op wort-agarmedium met toevoeging van de bestudeerde geneesmiddelen in concentraties van de werkzame stof 0.1; een; 1 ppm (mg / l) (voor fludioxonil en difenoconazol), 10; tien; 1 ppm (voor azoxystrobine) en in media zonder fungicide (controle). Het fungicide werd toegevoegd aan het gesmolten medium afgekoeld tot 10 ° C, waarna het medium in petrischalen werd gegoten. Een agarblok met schimmelmycelium werd in het midden van een petrischaal geplaatst en in het donker gekweekt bij een temperatuur van 100 ° C. Na 60 dagen incubatie werden de diameters van de kolonies gemeten in twee onderling loodrechte richtingen; de meetresultaten voor elke kolonie werden gemiddeld. De experimenten werden in triplo uitgevoerd. Op basis van de resultaten van de analyses werd de EC24 berekend, gelijk aan de concentratie van het fungicide, die de radiale groei van de kolonie halveerde ten opzichte van de fungicide controle.
resultaten en discussie
Op petrischalen met wortagar vormde de schimmel kolonies met wit vlokkig mycelium. Het medium onder het mycelium werd roodbruin. Toen het medium droog was, vormde de schimmel sporen van twee soorten op enkele en geaggregeerde conidioforen in kleine sporodochia. Macroconidia zijn langwerpig, cilindrisch, met één tot drie septa, gemiddelde lengte 27.2 µm met een bereik van waarden van 23.2 tot 32.2 µm, breedte - tot 4.9 µm (Fig. 1). De gemiddelde lengte van microconidia is 14.3 µm met een bereik van waarden van 10.3 tot 18.1 µm, de breedte is maximaal 4.0 µm. Alle macro- en micromorfologische kenmerken passen in het variatiebereik van de soort Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
De sequenties van soortspecifieke DNA-regio's (ITS, b-tubuline, TEF 1α) vielen volledig samen met de sequenties van de I. crassa-stammen die we eerder bestudeerden (Chudinova et al., 2019, tabel 1). Om de prevalentie van I. crassa in andere regio's te bestuderen en het spectrum van aangetaste culturen te analyseren, werden vergelijkbare DNA-sequenties in de GenBank-database geanalyseerd (tabel 1). De overlap was 86 tot 100%. De sequenties van alle drie de DNA-regio's van de “aardappel” I. crassa-stam waren identiek aan de sequenties van de stammen geïsoleerd uit de leliebol en narciswortels in Nederland en uit de ginsengwortel in Canada. We konden geen andere I. crassa-stammen vinden met drie geanalyseerde analoge sequenties in open databases. Analyse van de gedeponeerde ITS- en b-tubulinesequenties toonde echter de aanwezigheid van I. crassa op tulpenbladeren in het VK. Schimmels met een vergelijkbare ITS-sequentie werden geïdentificeerd in de analyse van de mycobiota van espwortels in Canada en beukenwortels in Italië, aardappelknollen in Saoedi-Arabië (tabel 1). De resultaten van deze studie laten zien dat I. crassa een wereldwijde verspreiding heeft en verschillende plantensoorten kan infecteren.
Bij het bepalen van de pathogeniteit op schijfjes tomaat en aardappel op dag 5, bereikte de diameter van de laesie 1.5 cm. De onderzochte stam infecteerde niet de hele tomatenfruit en de intacte aardappelknol. De kelkblaadjes waren echter aangetast op de tomaat. Om de mogelijkheid van besmetting uit te sluiten, werd een schimmelsolaat uit het mycelium ontwikkeld op een aardappelknolschijfje geïsoleerd in een zuivere cultuur. Het was volledig identiek aan de ouderlijke stam. Blijkbaar is I. crassa een wondparasiet.
Voorplantbehandeling van zaadknollen met fungiciden vermindert de ontwikkeling van ziekten op planten tijdens het groeiseizoen. Voor de selectie van effectieve fungiciden is het belangrijk om te beoordelen welke van hen effectief zijn tegen I. сrassa. Het werk bestudeerde de wijdverspreide werkzame stoffen van fungiciden - fludioxonil, azoxystrobine, difenoconazol. Fludioxonil is opgenomen in verschillende mengsels die worden gebruikt voor het aankleden van zaden en zaadknollen vóór het planten. Fludioxonil (Maxim) wordt ook gebruikt om zaadknollen te behandelen voordat ze worden opgeslagen. Difenoconazol en azoxystrobine zijn ook opgenomen in een aantal preparaten die worden gebruikt voor het verwerken van zaadmateriaal, evenals in preparaten die bedoeld zijn voor het verwerken van vegetatieve planten (Staatscatalogus ..., 2020).
De groeisnelheid van I. crassa werd bestudeerd op media (Fig. 2) met verschillende concentraties actieve stoffen: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobine (EC50 = 4 ppm) en difenoconazol (EC50 = 7.4 ppm) (Tabel 2). Deze preparaten kunnen als zeer effectief tegen I. crassa worden beschouwd, aangezien hun EC50 aanzienlijk lager is dan de aanbevolen concentratie van het preparaat in de werkvloeistof die wordt gebruikt voor de behandeling van knollen. Volgens de staatscatalogus ... (2020) is de concentratie van fludioxonil in de vloeistof voor de behandeling van aardappelknollen van 500 tot 1000 ppm, azoxystrobine (in de vloeistof voor de behandeling van de bodem van de voor) - 3750-9375 ppm, difenoconazol (in de vloeistof voor de behandeling van vegetatieve planten) - 187.5– 625 ppm.
Tabel 1. Overeenstemming van sequenties van soortspecifieke sequenties van stam 18KSuPT2 en stammen van Ilyonectria crassa beschikbaar in de Genbank-database
Zeef | Waardplant, plaats van uitscheiding | Volgnummers gedeponeerd in GenBank, percentage overeenkomsten | Link | ||
HAAR | β-tubuline | TEF 1α | |||
17KSPT1 en 18KSuPT2 | Aardappelknol, regio Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, dit werk |
CBS 158/31 | Narcissus roots, Nederland | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Leliebol, Nederland | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginsengwortel, Canada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulpenblad, VK | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Aspenwortels, Canada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Beuken, Italië | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Directe indiening |
KAUF19 | Aardappelknol, Saoedi-Arabië | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = niet gestort
Tabel 2. Weerstand van Ilyonectria crassa tegen fungiciden
(werkzame stof) | EC50, ppm | ||||
3 dag | 5 dag | 7 dag | |||
Controle | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenoconazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
In ons werk werden I. crassa-stammen geïsoleerd uit aardappelknollen in de regio's Kostroma en Moskou (Chudinova et al., 2019). Een groot aantal schimmelstammen met ITS-sequenties identiek aan I. crassa werd onthuld bij analyse van de mycobiota van aardappelknollen in Saoedi-Arabië (Gashgari en Gherbawy, 2013). Blijkbaar is I. crassa niet zo zeldzaam op aardappelen als het lijkt. Onze experimenten toonden aan dat de schimmel beschadigde tomatenvruchten kan infecteren. Uit de literatuur is bekend dat I. crassa zich saprotroof in de bodem kan ontwikkelen (Moll et al., 2016), en ook een verscheidenheid aan planten kan infecteren, zelfs taxonomisch verre planten zoals narcissen, lelies, ginseng, esp en beuk (tabel 1). een). Blijkbaar kunnen veel wilde en tuinplanten reserves zijn van I. crassa. Uit het bovenstaande blijkt dat bij het ontwikkelen van beschermingsmaatregelen rekening moet worden gehouden met de mogelijkheid om aardappelknollen met deze schimmel aan te tasten. Bij wijdverbreide preparaten voor de behandeling van aardappelknollen die fludioxonil, azoxystrobine en difenoconazol bevatten, is een hoge fungicide werkzaamheid tegen I. crassa aangetoond.
Dit werk werd ondersteund door de Russische stichting voor basisonderzoek (subsidie nr. 20-016-00139).
Het artikel is gepubliceerd in het tijdschrift "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)